植酸酶的酶活測定時需要了解的問題

胡文輝 · 發表于 2009-7-6 15:48:22

譯者楊威
原作者NELSON E.WARD
DONNIE R.CAMPBELL

盡管飼料工業中淀粉酶應用已經很多年，但豬雞飼料中植酸酶的快速廣泛使用卻是前所未有的。植酸酶的廣泛應用帶來了新的挑戰，那就是在植酸酶活力的表達和測定方法上還未能形成統一的規定。
隨著植酸酶檢測方法的不斷修改，新的檢測方法正在被研究。很顯然植酸酶本身的活力在被測定時不會被改變，這與淀粉酶、生長促進劑、球蟲和其他飼料添加劑的情況相同。在沒有統一酶活單位的情況下，這些產品習慣上由一些生產廠家進行檢測分析。
日糧中，植酸酶如何替代無機磷是很關鍵的，因為磷對動物體的生化功能和骨骼發育非常重要。因此，對植酸酶酶活檢測方法及酶活單位表述的理解顯得更加重要。在此，我們綜述了植酸酶的檢測方法，講述了當酶活檢測方法不同的情況下對確定酶活單位時那些非常規方法的關注。

不同性質

植酸酶是一種具有精確性和專一性的催化劑，當它的結構被修改，其活力也因此被破壞，構型的微小變化都會引起植酸酶與目標底物－植酸結合能力的顯著改變。由于蛋白對溫度，PH這些因素的敏感，所以蛋白發揮作用所在的環境至關重要，不是所有植酸酶在相同條件下反應都一致。
植酸酶酶表達和發酵條件的不同，可以通過糖基化作用或者植酸酶分子與糖類的連接的方式改變植酸酶（Wyss 等1999a），而這些會削弱植酸酶的構造、穩定性和活力（wang 等1996）或者改變其動力學基礎。黑曲霉植酸酶的糖基化可分別引起在酶活活力和熱穩定性上9%和40%的差異（Han 等1999），但是有一些植酸酶可以不受影響（Wyss等1999）。
礦物質在植酸酶的作用中起很重要的作用。在溶液中，一些植酸酶的活性會因為結合了鈣離子的EDTA的存在而失活。在這個研究中，在缺乏鈣離子時，圓二色光譜方法在分子構型上顯示出了有意義的變化（Kerovuo等2000），表示這種植酸酶需要鈣離子。相反，對不同的植酸酶，EDTA具有相反的作用（Wyss 等1999）。
植酸酶對ph尤其敏感，因為蛋白氨基酸殘基的離子狀態可能會控制其催化能力。不同植酸酶的最優ph也不同。因此，在化學分析中一個特定的ph可能只是對一種植酸酶有利，而對其他植酸酶不利，但是，小腸消化中的ph范圍可能會使這些植酸酶發揮相似的作用。
植酸酶作用的發揮受溫度的限制，出于這個考慮，檢測植酸酶活力時必須選擇介于“最佳”溫度（植酸酶表現最高的酶活）和“目標動物所需要的溫度（可能不是酶活最高的溫度）”之間。
關于植酸酶人們進行了大量的試驗，每一個試驗都具有獨特性。單個因素（如ph，胃蛋白酶穩定性等）在體外試驗中的反應已經限制了人們對動物體內植酸酶活力的預測（Simon 和Igbasan2002），因為，酶的功能應該是影響它們活力的所有因素共同作用的結果。最終，消化道的主導條件會調節這些個別因素。

酶活單位混亂

因為植酸酶的生化特性變異較大，所以沒有一個表達植酸酶活力的國際標準（Selle和Ravindran，2006），這造成在檢測不同來源植酸酶酶活時的混亂，尤其是在用相同的活力單位名稱（FTU）檢測時（見表1）。檢測過程中與實驗室間差異無關的其他變異也會導致在植酸酶活力單位表述上3-4倍的差別。
修改植酸酶檢測方法越來越普遍。不是不正確，只是所有的檢測方法都使用FTUs作為單位是不合適的，它可以導致錯誤的產品評價。在2002年，FEFANA（歐洲飼料添加劑生產商協會）認識到這一問題并開始致力于在14個商業和政府實驗室間統一這個分析方法（FEFANA2005）.

分析原理

現行的植酸酶檢測方法是建立在與AOAC檢測方法相似的基礎上的（Engelen，2001），包括3個主要的步驟：提取、培養和分光光度計定量（圖1）。現行的分析方法是Gist－brocades/DSM研究出來用于它們的黑曲霉植酸酶檢測的。
簡而言之，AOAC分析方法是基于飼料樣品中提取出來的植酸酶從植酸鈉底物中釋放出磷的基礎上的。選擇Ph5.5是因為對黑曲霉植酸酶來說它是最優ph（Engelen ，1994）而選擇37℃因為它與動物的消化道溫度相似。
含有氯化鈣的乙酸緩沖液（鈣離子作為輔助因子）和植酸鈉被用作分離和培養飼料中的植酸酶。然后，酸性的釩酸鉬試劑用于2個反應：終止60分鐘的培養及與釋放出來的無機磷形成黃色的復合物。
在415nm，分光光度計測定亮度，在黑曲霉植酸酶標準曲線的基礎上用這個讀數去估計樣品中的植酸酶活力（Engelen，2001）。當檢測其他來源植酸酶時使用黑曲霉的標準曲線是值得懷疑的，因為在相同的條件下這些酶很少與黑曲霉同步反應。最終，一個植酸酶酶活單位（FTU）定義為在ph5.5，37℃下每分鐘從5.1mM植酸鈉中釋放1uM的無機磷所需要的植酸酶的量。

分析方法的修改

FTU定義中沒有描述緩沖液、緩沖液濃度、酶的輔助因子或者完成反應所需要的時間。這個酶活定義完全集中在分析條件上，而沒有反映出對改變結果其關鍵作用的隱藏在幕后的那些差異。

緩沖液

在這個酶活單位定義中一個很重要而未被確認的因素是緩沖液。乙酸緩沖液正在成為植酸酶分析中最常用的緩沖液，檸檬酸（Rodriquez等2000）和硼酸（Basu等2006）也被使用過。
我們發現商業植酸酶（真菌和細菌）的活力，用檸檬酸作為緩沖液其檢測值只有乙酸緩沖液的65-70%（表2）。對于相同的植酸酶樣品，檸檬酸緩沖液的檢測值為250單位時，如果用乙酸緩沖液分析其值為750單位。而這種緩沖液上的差異不會影響所有的植酸酶，所以就使得解釋這兩種緩沖液對植酸酶活力單位的影響變得很困難。
相似的，檸檬酸和乙酸緩沖液的不同摩爾濃度對植酸酶的熱穩定性也有很重要的影響（Rodriguez，2000）。Dalsgaard （2007 ）提到乙酸和檸檬酸緩沖液對削弱2個大腸桿菌植酸酶的相對活性有主要的作用。BASU （2006）得出制粒飼料中的植酸酶的酶活結果取決于ph、化學特性和緩沖液濃度。他們已經成功使用硼酸緩沖液（ph＝10）測定大腸桿菌植酸酶并且討論了轉換單位“QPU”為 FTU”時需要校正的因素。
值得注意的是，螯合劑如檸檬酸鹽（和EDTA）可能會增打植酸酶活性結果，可能原因是減少了植酸鈣中有效鈣離子。（Maena ，1999）。使用各種不同的緩沖液和螯合劑得出不一致的檢測結果（Greiner，1997；Shimizu，1992；Yoon,1996），可能因為不是所有植酸酶都是金屬酶或者它們需要不同的輔助因子，再或者或者植酸鹽礦物質復合物的形成被阻止。

緩沖液pH

盡管大多數植酸酶在pH4.5-6.0之間有一個最優pH，但是檢測時一般采用pH5.5，而一些植酸酶在此pH下活力只有最佳活力的70%或者更少（Rodriquez，2000），而對于其他的植酸酶來說，pH5.5可能是它們最優的pH（Engelen，1994）。
在對比2個檢測方法中的pH（圖2）時，我們發現一些商業植酸酶的活力可能受其影響較大。同樣在較低的ph下，一個植酸酶的酶活增加了170%，另一個卻降到只有5%，而另外一個的活力卻幾乎不受影響。
進而，在這個ph條件下，同一個植酸酶產品的兩個不同劑型表現出20%的差異。當產品劑型增加時，這可能會成為大的問題。我們的試驗表明造型產品可能要求更多的分析程序以確保樣品中植酸酶的完全提取。
在特定pH下活性的減少可能不是真實反映，因為植酸酶可能折疊或復原，這取決于植酸酶蛋白的變性程度。環境和pH的共同影響會使小腸消化道運載植酸酶的效率變得忽高忽低。
當然，一般情況下，動物體內的真實條件不同于實驗室、體外試驗中所采用的特定某點的pH。圖2中植酸酶A 就是這樣一個例子，體外某點pH下其酶活較低，但是根據動物試驗，植酸酶A 可以提供約0.1%有效磷。

緩沖液添加劑

有些植酸酶需要鈣（Kerovuo，2000），所以氯化鈣通常被添加到緩沖液中，其添加量并不固定有時可能完全不加入氯化鈣。根據植酸酶的檢測結果，鈣離子缺乏可能會降低酶活結果（Sequeilha 等1992）。
另一方面，過量的鈣會形成難于降解的不溶性植酸鈣。但在大多數的植酸酶檢測中，這可能不會是一個大問題，因為植酸結合鈣是發生在中性pH條件下。在pH5.0時，鈣對植酸酶（黑曲霉）降解植酸的影響很小（Maenz，1999）。例如，植酸酶分析大多都在pH5.5。
通過4種商品植酸酶，DSM研究（Vogel，2005）發現AOAC中氯化鈣的水平使一種植酸酶的酶活增加了40%，但是卻降低了另一種植酸酶的酶活分析值。因此，緩沖液中一些輔助因子的內容物對酶活有一定影響。

溫度

植酸酶的最佳溫度一般都在37℃以上（Lei 和Porres，2003），而37℃時酶活只有最大酶活的40-60%。植酸酶酶活檢測一般都在37℃下，盡管目前有一個方法是在60℃下測量大腸桿菌來源的植酸酶酶活（Basu等2006），但這個溫度已經超過了豬、禽的體溫。培養溫度的改變肯定會影響酶活結果。

飼料中提取植酸酶及培養時間

檢測方法中，從飼料中提取植酸酶的時間和對植酸酶的培養時間是不同的，關于培養時間的報道也很少。我們期待提取或培養植酸酶時間上的改變會影響植酸酶。此外，顆粒飼料中植酸酶的提取可能需要特別的條件（Basu,2006）。

底物

植酸酶檢測中利用植酸鈉作為底物，它比飼料中的植酸更容易被降解（Selle，2006）。植酸易于結合飼料中各種成分，尤其是二價陽離子如鈣離子（Pallauf 和 Rimbach，1997）。但是植酸鈣不如植酸鈉容易水解（Maddaih,1963）.
另外，基于對底物的特異性，Wyss （1999b）把植酸酶分為2類。一個是作用范圍狹窄、特定作用于植酸的植酸酶，另一個是其偏向作用于一定范圍磷復合物的植酸酶。值得注意的是，在體外試驗中，更多的磷由植酸酶從飼料中釋放出來，表明一些磷的復合物可以作為底物。
固有的底物限制了植酸酶的檢測，檢測方法中不同底物的應用必將拓展目前植酸酶檢測的條件。
另外，植酸鈉供貨出現了中斷。植酸鈉主要供應商現在提供的植酸含有高水平的無機磷并且不穩定，這將促使植酸酶結果的不確定性。DSM目前正從其他供應商處篩選植酸鈉作為底物。

實踐中的分析差異

以前，我們發現植酸酶結果存在很大的差異，這引起了我們的關注。例如圖3中，不同廠家商業飼料的樣品，用2個的植酸酶分析方法各自在2個不同的試驗室進行分析。然而，在不同的實驗室分析導致結果存在差異，在此試驗中，存在25-60%的差異。

最后的說明

植酸酶的檢測為我們提供了一個基本的產品保證和制定標簽的依據，酶活檢測和生產性能的聯系必須建立在磷替代試驗基礎上，因此，檢測酶活和產品間有了聯系。然而，植酸酶酶活的檢測方法總是變化，但這不影響所有的植酸酶。植酸酶的評價需要在評估前對分析方法有一定的理解。

圖1 植酸酶分析方法的一般程序
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圖2 乙酸緩沖液為0.25M時，pH對植酸酶酶活的影響
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（以pH=5.5時的酶活作為100%）

圖3，兩個不同的植酸酶檢測方法中，飼料樣品中植酸酶的酶活
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注：兩個分析方法都是商業上的檢測方法
資料來自于DSM營養公司。

表1，不同生產廠商的植酸酶分析方法的差異

分析方法	酶活單位1	樣品	提取植酸酶的時間	培養		是否加入輔助因子	標準曲線	吸光度
分析方法	酶活單位1	樣品	提取植酸酶的時間	緩沖液	時間分鐘	是否加入輔助因子	標準曲線	吸光度
A	FTU	5	60	乙酸	60	是	酶（黑曲霉）	415
B	FYU	80	45	乙酸	30	否	磷	415
C	FTU	10	10	乙酸	30	是	磷	415
D	FTU	60	60	檸檬酸	15	是	磷	820

1酶活單位是指：在pH5.5，37度下，每分鐘從5.1mM植酸鈉溶液中釋放出1uM磷所需要的植酸酶數量。

表2，不同分析方法中商業植酸酶的活力

分析方法1	0.25mM緩沖液，Ph5	植酸酶樣品
分析方法1	0.25mM緩沖液，Ph5	黑曲霉	大腸桿菌	大腸桿菌	大腸桿菌	P.lycii
DSM	乙酸	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
AOAC	乙酸	1.08	1.19	1.11	1.14	1.10
C2	檸檬酸	0.53	0.31	0.34	0.31	0.32
D2	乙酸	1.04	1.25	1.20	1.23	1.11