鹽霉素的檢測

Elen

請問配合飼料中的鹽霉素如何檢測，檢測的準確性如何？

wangyuxia1234

一起等待答案！！！！

nzhqlucky

高效液相檢測鹽霉素效價

一、
鹽霉素效價檢測現有方法簡介：
鹽霉素效價檢測使用的是微生物效價測定法中的管碟法，是利用微生物在特定培養基上的擴散作用，用已知效價的標準溶液與未知效價的樣品溶液在含有短小芽孢桿菌的特定培養基上對照培養，根據產生抑菌圈的大小來計算樣品的含量。
二、
課題選擇
由于傳統的微生物測定法耗時長、誤差大，重現性差、成本高等諸多弊端，已不能滿足現代化生產的需要，隨著現代化生產的需要，隨著中國加入世貿組織和企業進行FDA認證，企業面對的市場不僅僅是國內，而且還有國外市場，目前歐洲許多國家已不再使用微生物測定法測定藥品的含量，而是改用先進的、更可信的HPLC法，因此為了提高檢測的準確度，進一步完善鹽霉素產品的質量控制標準，選擇“高效液相檢測鹽霉素效價”。
三、
現狀調查
1)
檢測方法的調查           抑菌圈圓正及大小的影響

     標準品與供試品不同質    藥液的飛濺           培養基內有小凝塊
培養基溫度不均勻

器具被污染
含有影響抗菌活性      試劑中賦型劑的影響        
                               培養基雜質

鋼管底部不平滑
物標準品與供試品不同

                                    緩沖液ph和鹽濃度的影響

培養基溫度、擴散
所用緩沖液不同

溶解所用溶劑不相同


批

                                                    系數、溶液濃度

                             

                                                     方法誤差

細菌生長時間不同        菌種分離純化不及時        


檢定菌放置時間過長                        
        
                  檢定菌                     恒溫室溫度不穩定
2)
檢測成本調查：生測法所使用的試劑多達10種以上，370恒溫室耗電量大，所用玻璃器皿成本高，致使單批測量成本60元左右，工段月成本高達12000元。
3)
人員調查：崗位化驗員雖有多年工作經驗，但由于檢測方法完全由手工操作，過程繁瑣，工作量大，影響因素較多，易出現操作誤差，且人員的工作效率較低。
4)
儀器調查：抑菌圈測定儀重復掃描，重現性差，誤差在1-2％,致使同批樣品精確度差不能確保有良好的準確度。
5)
試劑調查：所用試劑種類繁多，雜質含量高，影響擴散系數，從而造成測定結果不穩定。
6)
環境因素調查：因為被廢棄的培養基內帶有活的菌體，排放后對環境產生污染。
四、
活動目標
1)
使檢測誤差控制在5％以下，提高檢測的準確度。
2)
減少勞動量，節省人員，降低單批測定的成本。
3)
避免帶活菌體污物的排放，減少環境污染。
原因分析：降低檢測偏差的可控因素進行分析。

降低偏差		改變現有的檢測方法		降低成本
		盡量減少手工操作
		選用更為精密的儀器
		加強崗位員工的培訓

造成偏差較大的因素有以下幾種：

放置時間過長

菌絲

雜菌的影響

Ph及鹽濃度不合規定

恒溫室溫度不穩定

組分配不同

物質不同

賦型劑的影響

鑒定菌的質量

操作條件

加熱溫度過高

標準品與供試品不同質

檢測方法

被污染

雜質引起菌種擴散

擴散系數

操作人員技能

習慣操作太多

試劑純度

理論知識薄弱

操作不規范

檢測偏差大

人員的主觀意識

儀器損耗

改用新方法，以提高檢測的準確度及穩定性，使誤差控制在5％以下，并降低檢測成本。


對上述找出的可控因素進行分析確認：

序號	原因	要素確認	是否原因	備注
1.	檢測方法	檢測偏差超出5％	是
2.	儀器的穩定性	重復測定誤差在1-2％	是
3.	人員的主觀意識	手工操作煩瑣，失誤較多	是
4.	試劑的純度	雜質有可能對測定結果產生影響	否
5.	標準品與供試品不同質	二者直線不平行，斜率不等	否
6.	操作人員技術不穩定	試驗操作誤差	是
7.	檢定菌的質量	影響抑菌圈的清晰度形成	否
8.	擴散系數	測定結果的穩定性	是
9.	操作條件	影響抑菌圈的圈正和大小以及培養溫度不穩定從而影響測定結果	是
10.
11.

六 制定對策
（一）我們對以上分析找出關鍵因素制定對策：

序號	要因	現狀	措施	完成時間	主要負責人
1	標準品與供試品不同	引起檢測誤差過大超過5%	尋找新的方法改變要因對測量結果的影響
2	擴散系數
3	操作條件
4	操作人員技術不穩定
5	儀器的穩定性	穩定性差	選用更為先進的儀器
6	人員的主觀意識和技能	理論知識及操作技能較差、習慣操作太多	加強培訓、提高水平

（二）加強培訓與考核為度
利用工段會的機會對崗位員工進行授課，培訓HPL的理論及實際操作知識，使每位員工都能熟練掌握操作技能，改變習慣性操作，并符合GMP的規定，盡可能地減小操作偏差更好地服務生產，同時加大考核及抽檢的力度，加強員工的責任心，從而督促每一位員工加強學習，不斷提高干好本職工作。
七　對策實施：
針對檢測方法中引起偏差的原因我們計劃采用：藥典及國際通用的HPLC法檢測鹽鹽霉素含量，從而達到降低偏差、減少工作量、提高工作效率，增加數據可信度，提高產品質量信譽。查閱有關資料及文獻，使用
**方法并對方法中的色譜條件進行論證


1.
固定條件：
確定設備條件：（Agilend1100高效液相色譜儀）表 、L18反相色譜柱、20ml定量環
2.
色譜條件的論證（甲醇V：香草醛W：硫酸V＝95：4：0.6）流速0.6ml/min,柱溫35℃、反應溫度100℃、檢測波長520nm。
（1）
流動相比：甲醇V：冰乙酸V：水V
制備配比為93：7：0.1、94：6：0.1、95：5：0.1、96：4：0.1、96.4：3.6：0.1、97：3：0.1六種流動相，發現流動相含量高時，靈敏度和峰面積都有較高的表現，但有沒有分開的峰，有機相低時雖然所有的峰分離效果很好，但其響應卻低，有機相含量在95－96%時較好的分離及響應值，選擇配比95：5：0.1做為流動相配比。
（2）流動相流速的確定：流動相配比按95：5：0.1時選拔擇流速，使用0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min七種流速發現流速低時響應值及分離度都有較好的表現，原因是因為流速低時，柱的反應能有充分的時間，但其峰形和出峰時間較差，流速高時峰形好但其響應及分離度不好，權衡利弊，確定流速為0.8ml/min為宜
（3）衍生劑濃度的探索，流動相配比（95：5：0.1）。流速為0.8ml/min.先用四種配比，甲醇v:香草w:濃硫酸v(95 :32:0.5,95:4:0.5,95:5:0.5,95:6;0.5)，香草濃度在4%以上時響應值和分離度較好，沒有太大的改變。而濃度低時由于反應不會完全而響應值不高。再提高硫酸的濃度為0.6時。響應值更好，所以選擇了95：4：0.6。
（4）反應池溫度的探索，
固定條件：流動相配比為（958：5：0.1）流速為0.8ml/min.衍生劑配比為95：4：0.6，選擇溫度90oc,95 oc,100 oc,105 oc,110 oc,隨著反應池溫度的提高，響應值有所提高，峰型不受影響，但溫度過高儀器受到的傷害較大，長期受高溫對反應池也有腐蝕，不能長時間使用，選定100 oc時其響應值就能滿足要求。
（5）柱溫度的探索
固定條件：流動相配比為（95：5：0.1）流速為0.8ml/min,衍生配比95：5：0.6反應池溫度為100 oc
改變柱溫度分別為25oc,30 oc,35 oc,40 oc,45 oc,5種情況，發現只有出峰時間響應值有較小改變峰型基本上不變。由于溫度過高可能導致固定相的長期流失引起柱效減低，故在常溫下操作即可，柱溫度確定為35 oc
（6）進樣量的探索
固定條件：流動相配比為（95：5：0.1）流速為0.8ml/min,衍生劑（95：5：0.6）流速0.3 ml/min反應池溫度為100 oc，柱溫度35 oc
選用20μl的定量環，進樣濃度為1000μ/ml,800μ/ml,500μ/ml,200μ/ml,100μ/ml,150μ/ml.發現進樣量高時，峰的對稱性不好，有可能引起超載，大大縮短色譜柱的壽命，進樣量太少則引起相對誤差較大，建議濃度為100μ/ml即為2μg
3最佳色譜條件的確定：
檢測波長：520nm,流動相配比甲醇V：冰乙酸V:水V=95:5:0.1,流速0.8ml/min衍生劑配比（甲醇v:香草w:濃硫酸）95：4：0.6，衍生劑流速0.6ml/min，反應池溫度100 oc，柱溫度35 oc，進樣量為2μg
流動相及衍生劑必須經過脫氣防止氣泡產生
4 樣品提取，根據估計效價精確稱取一定量的樣品，用20ml的色譜極甲醇提取，浸泡30min ,震蕩提取30min，過濾棄去初濾液，再取1ml至10ml容量瓶中定容得100μ/ml的樣品用0.45μm的微孔濾膜過濾即可進樣。
5 標準品的制備：精確稱取50mg左右的標準品至50ml容量瓶中，用甲醇定容再分別吸取2.25ml，2.5 ml，2.75 ml的標準液至25 ml容量瓶中，即得10μ/ml，100μ/ml，110μ/ml的標準液做儲備液，用來作曲線，用外標法測鹽霉素含量。
八 效果檢查：
1)
色普條件
C18反相色普柱（大連依利特）流動相（甲醇V：水V：冰V＝95.5：4.5：0.1），流速0.8ML/MIN,衍生劑（甲醇V：香草醛W：硫酸V＝95：4：0.6）20UL定量環，柱溫350c，反應池溫度1000c，檢測波長7MIN左右。
2）準確度
在已知含量的鹽霉素粉劑和顆粒中添加一定量的對照品，再做添加后樣品中鹽霉素的含量。算得樣品添加含量回收率如下表：

	已知含量ug/mg	添加后含量ug/mg	回收量ug/mg	回收率％	平均回收率％
F1	131.68	146.47	145.85	99.6	99.73
F2	131.68	146.47	146.57	100.1
F3	131.68	146.67	145.85	99.6
K1	125.59	140.46	140.89	100	99.49
K2	125.59	140.66	139.95	99.5
K3	125.59	143.51	142.05	98.98

2)
線性及線性范圍
配制90u/ml, 95u/ml、 100u/ml、 110u/ml系列標準液,并利用面積作為響應值，作曲線得Area=3.34989Amt+1.3.278,相關系數r=0.9999,說明其在1.8ug-2.2ug之間具有良好的線性。
3)
精確度
對同一批粉劑和顆粒分別作三個平行樣得結果如下表：

	測得含量ug/mg	平均含量ug/mg	RSD%	平均RSD%
F1	131.04	131.68	0.5	0.6
F2	132.53		0.6
F3	131.49		0.7
K1	126.95	125.59	1.1	0.7
K2	124.72		0.7
K3	125.11		0.4

4)
樣品穩定性
對同一樣品進行放置一段時間測量，得如下數據，說明樣品24小時之內具有良好的穩定性：

	2h	4h	8h	20h	24h
A	309	308	308	307	307

5)
重現性
對同一樣品重復進樣三次，所得數據如下表，說明此方法具有較好的重現性。

	出峰時間	峰面積	峰高	峰寬
1	7.109	304.0	27.7	0.1688
2	7.125	304.4	28.0	0.1690
3	7.131	303.0	27.8	0.1678

由于傳統的生物測定法，耗時長、誤差大、重現性差等弊端已不能滿足現代化生產的要求。而本方法具有良好的精密度、重復性、準確度并且簡單易行。為進一步完善鹽霉素產品的質量控制標準提供了良好的檢測方法。

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高效液相色譜柱后衍生化法測定飼料中鹽霉素張素霞
沈建忠
賈明宏
［摘要］對高效液相色譜柱后衍生化測定飼料中鹽霉素的方法作驗證研究。采用C18反相柱，甲醇—冰乙酸—水為流動相，香草醛為衍生劑。方法檢測極限為0.5μg/ml，添加回收率為85.6%，變異系數為4.92%。
　　關鍵詞　高效液相色譜柱后衍生化　鹽霉素　　鹽霉素(Salinomycin)是一種聚醚類單羧酸化合物，鹽霉素鈉鹽作為一種飼料添加劑主要用于防治家禽球蟲病，也用于改善肉雞生產性能，其在飼料中的添加濃度為60mg/kg，當濃度超過100mg/kg時則對肉雞生產性能產生不良影響。
　　最初對飼料中鹽霉素的檢測方法主要為比色法及生物測定法。80年代后發展了采用各種衍生劑的高效液相色譜法，其中高效液相色譜柱后衍生化法(HPLC—PCD)具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、便于自動化等優點。國外已有一些研究報道，國內這方面的研究工作剛剛開始，我們采用香草醛為衍生劑，進行了高效液相色譜柱后衍生化測定飼料中鹽霉素的方法研究，取得了良好結果。
1　材料與方法
1.1　儀器和試劑　高效液相色譜儀(泵SP8810，紫外檢測器SP8450，積分儀SP4270)，北分BFS—5106型柱后衍生化裝置，鹽霉素標樣(美國Sigma公司)，甲醇(優級純)，蒸餾水為全玻璃重蒸，香草醛等其余試劑為分析純。
1.2　標準品和溶液的配制
　　流動相：甲醇—冰乙酸—水(940∶60∶1，v/v)；
　　香草醛衍生液：將20g香草醛溶于冷卻的甲醇—硫酸(250+5，v+v)溶液中，避光，現用現配；
　　樣品提取液：甲醇—水(90∶10，v∶v)
　　標準溶液：準確稱取一定量的鹽霉素標樣，用甲醇配制成1000μg/ml的標準貯備液，用甲醇—水(90∶10，v/v)稀釋成2.0、5.0、10.0、25.0μg/ml系列濃度的標準溶液。
1.3　飼料樣本的提取　稱取20g飼料樣品于250ml具塞三角瓶中，加入100ml樣品提取液，在往復震蕩器上震蕩45分鐘，靜止片刻，過濾上清液，取部分上清液用0.45μm濾膜過濾后進行HPLC—PCD測定。
　　樣本添加回收率的測定設3個添加水平，濃度分別為30、60、120mg/kg，每個水平作3個重復，樣本的前處理過程同上。
2　結果
2.1　色譜條件及保留時間
　　色譜柱：C18反相柱，250×4.6mm id，粒徑5μm；
　　檢測波長：520nm
　　流動相流速：0.8ml/min
　　衍生液流速：1.6ml/min
　　反應溫度：95℃
　　反應管：0.2mm×10m
　　進樣體積：200μl
　　鹽霉素的保留時間：13.6分鐘
2.2　標準曲線
　　在上述色譜條件下，測定標準溶液濃度系列的響應值，繪制標準曲線，其線性回歸方程為Y＝-152.2+383.0X，相關系數為0.9992。
濃度(μg/g)
2.3　添加回收率
　　3個水平3個重復的添加回收率見附表。
附表　飼料中鹽霉素添加回收率
　檢測濃度 μg/g回收率 %變異系數 %
3024.581.7
3027.090.0
3026.588.3
平均值26.086.75.05
6048.080.0
6054.590.8
6052.587.5
平均值51.786.16.42
12098.081.7
120100.083.3
120104.587.1
平均值100.884.03.30
3　討論
　　本文研究了使用高效液相色譜柱后衍生化系統測定飼料中鹽霉素的方法，通過參考有關文獻，進行了對流動相的組成、香草醛衍生液的濃度、流動相和衍生液的流速比例等測試條件的多次試驗，選擇了上述的最佳色譜條件。從表1可以看出：使用高效液相色譜柱后衍生化法測定飼料中鹽霉素回收率較高，在30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg3個水平上的平均回收率分別為86.7%、86.1%和84.0%，而且在每個水平上的3個重復變異系數都較低，分別為5.05%、6.42%和3.30%。另外，從鹽霉素標準曲線及回歸方程還可看出，使用高效液相色譜柱后衍生化法測定飼料中鹽霉素線性相關非常理想。
　　試驗證明本方法操作簡便易行，色譜條件易于掌握，測試數據重復性好，回收率較高，精密度和準確度都能滿足分析要求，是測定飼料中鹽霉素的可行方法。