甜菜堿的檢測

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分析方法

使用HPLC測定甜菜糖漿和液體或晶體甜菜堿產(chǎn)品中甜菜堿和某些其他成分的含量

前言
本方法可以用來檢測甜菜糖漿和液體或晶體甜菜堿產(chǎn)品中甜菜堿、某些糖和糖醇的含量。通過使用強(qiáng)陽離子交換柱（Na+,Ca2+或Pb2+形式〕的高效液相色譜（HPLC〕和折光率檢測器（RI）可以達(dá)到目的。

結(jié)晶芬菜堿S6產(chǎn)品中含有相當(dāng)數(shù)量的硬脂酸鈣，在進(jìn)行樣品預(yù)處理的時(shí)候必須考慮到這點(diǎn)。

用來進(jìn)行測定的HPLC系統(tǒng)必須有相應(yīng)的維護(hù)程序，交換柱和管線必需定期清洗以保持系統(tǒng)狀態(tài)的穩(wěn)定。

設(shè)備和試劑

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HPLC系統(tǒng)
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等速泵，0.6毫升/分鐘，如沃特斯公司的Waters 510
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自動進(jìn)樣器，如沃特斯公司的Waters 717+
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柱溫為75℃（Na-柱）或85℃（Ca-柱或者Pb-柱〕的交換柱，如沃特斯公司的Waters CHM
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RI檢測器，如沃特斯公司的Waters 410
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合成和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，如沃特斯公司的WatersMillennium

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Na或Ca形式的保護(hù)柱，Pb柱用陰陽離子交換預(yù)備柱的形式保護(hù)。可以使用如Bio-Rad125-0508(Na),Bio-Rad 125-0128(Ca),Bio-Rad 脫灰分柱125-0118(Pb)
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有機(jī)濾器，如Guard-Pak TM BondakapC18.Waters,Ltd.
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機(jī)械濾器，如Upchurch ScientificOn-line frit A103x
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分析柱，Na+、Ca2+或者Pb2+形式的強(qiáng)陽離子交換柱，如Transgenomic Coregel 87N或者CHO 820 和Bio-Rad Aminex HPX-87P?

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洗液，超純水（蒸餾，去離子，過0.2 um(微米)濾膜）適用于Pb柱，超純水配制的0.001MNa2SO4溶液適用于Na柱，0.001M Ca(NO3)2適用于Ca柱
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0.2um(微米)濾膜,如Schleicher& Schuell ME 24
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分析天平,如MettlerPC 440和Metttler AE100
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抽氣泵，如KNF MW63/4
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過濾系統(tǒng)，如Gelman
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水純化裝置，如Gelman Water-1→ultra pure water
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超聲波清洗器，如Branson 5200
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0.2um的注射過濾器，如Gelman Nylon Acrodisc 13
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加熱器
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冷卻水恒溫器(20±0.5℃)
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容量瓶,如100ml
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Na2SO4，如 Merck 6649
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Ca(NO3)2·4H2O，如Merck 1.02123
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甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)物，如Fluka 14300（一水化合物）
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KCl，如Baker0509
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棉子糖，如Merck 73301（五水化合物）
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蔗糖，如Fluka 84099
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半乳糖，如Merck 41726
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肌醇，如Fluka 57570
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果糖，如Merck，104007
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甘油，如ICN Biomedicals 800687
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赤蘚糖醇，如Acros 11782
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甘露醇，如 Fluka 63559
其他可能用到的物品。

操作程序
配制Na-柱沖洗液
稱取0.710克無水硫酸鈉放入5000ml容量瓶中，注入超純水至容量瓶容量的一半左右。加入幾滴1M NaOH溶液調(diào)整pH至9.0。混合均勻后加入超純水至刻度。

配制Ca-柱沖洗液
稱取1.18克硝酸鈣（含四個(gè)結(jié)晶水）放入5000ml容量瓶中，注入超純水至容量瓶刻度，然后混合均勻。

配制Pb-柱沖洗液
使用超純水

如果需要的話，可以將配制好的沖洗液經(jīng)0.2um的濾膜過濾（視水的質(zhì)量狀況而定）。將裝有洗液的5000ml容量瓶用超聲處理15分鐘后，將其接入HPLC系統(tǒng)。洗液應(yīng)該保持在60℃以防止產(chǎn)生氣泡。

標(biāo)準(zhǔn)液
精確稱取下述成分，然后在20℃條件下用蒸餾水稀釋至100ml。將稀釋好的樣品經(jīng)注射
過濾器（0.2um）過濾后收集到集樣瓶中。如果使用無水甜菜堿，應(yīng)該將其在140℃至少干燥24小時(shí)，然后儲存在干燥器中（最多存放兩周）。由于幾乎很難將無水甜菜堿完全保持干燥,因此可以使用含有一個(gè)結(jié)晶水的甜菜堿作為標(biāo)準(zhǔn)品,但是要經(jīng)常檢測其含水量(使用KarlFisher法)。

甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)樣		Pb標(biāo)準(zhǔn)樣	三點(diǎn)校正，標(biāo)樣1
Na-和/或Ca-柱	Pb-柱
KCl	120mg	蔗糖	200mg	KCl	120mg
蔗糖	200mg	葡萄糖	100mg	棉子糖	30mg
葡萄糖	80mg	果糖	300mg	蔗糖	100mg
半乳糖	80mg	甘油	200mg	葡萄糖	10mg
肌醇	80mg	赤蘚糖醇	200mg	半乳糖	10mg
甜菜堿	700mg	肌醇	250mg	肌醇	10mg
		甘露醇	250mg	甜菜堿	500mg
蔗糖標(biāo)準(zhǔn)樣				三點(diǎn)校正，標(biāo)樣2
Na-和/或Ca-柱
KCl	120mg			KCl	120mg
棉子糖	100mg			棉子糖	20mg
蔗糖	600mg			蔗糖	300mg
葡萄糖	80mg			葡萄糖	30mg
半乳糖	80mg			半乳糖	30mg
肌醇	80mg			肌醇	30mg
甜菜堿	150mg			甜菜堿	200mg
				三點(diǎn)校正，標(biāo)樣3
				KCl	120mg
				棉子糖	10mg
				蔗糖	500mg
				葡萄糖	20mg
				半乳糖	20mg
				肌醇	20mg
				甜菜堿	50mg

樣品溶液
如果可行的話用折射計(jì)測量樣品中干物質(zhì)的含量并將其轉(zhuǎn)換為甜菜堿的干物質(zhì)量(使用Brix/甜菜堿 干物質(zhì)表)。或者使用 Karl Fisher干物質(zhì)。準(zhǔn)確稱取大約1克（干物質(zhì) ）的樣品溶于100ml容量瓶中，用超純水定容至刻度。將樣品稀釋液通過注射過濾器（0.2um）
后收集到集樣瓶中。

結(jié)晶樣品：稱取0.7g（使用分析天平）晶體至容量瓶中，用超純水定容至100ml。將樣品稀釋液通過注射過濾器（0.2um）后收集到集樣瓶中。
芬菜堿S6 樣品必須充分混勻，因?yàn)槠渲械挠仓徕}難溶于水。稱取樣品（0.7g，使用分析天平）至玻璃瓶當(dāng)中，然后添加超純水至100.0000g。用玻棒充分?jǐn)嚢韬蟮谷牖旌掀髦校旌洗蠹s1分鐘使其充分作用。將充分混合后的樣品溶液通過注射過濾器（0.2um）后收集到集樣瓶中。


色譜分析
洗液：0.001MNa2SO4（Na-柱）或者0.001MCa(NO3)2（Ca-柱）溶于超純水中，通過0.2um濾器。對于Pb-柱,直接使用超純水。
柱溫：75℃（Na-柱）或者85℃（Ca-或Pb-柱）。
流速：0.6ml/分鐘（Na-和Ca-柱）或者0.6ml/分鐘（Pb-柱）。
進(jìn)樣量：10ul（微升）。
時(shí)間：Na-柱,15分鐘。如果樣品很臟或者含有洗脫很慢的組分時(shí)，跑柱時(shí)間可以延長到30～40分鐘以防止干擾下一次的測量。Ca-柱，35分鐘，Pb-柱,50分鐘。
使用外標(biāo)法測量。根據(jù)測得的峰高，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算出結(jié)果。如果柱子的狀態(tài)不佳并且波峰不尖的話，將根據(jù)波峰的面積而不是高度來計(jì)算。然而，大多數(shù)情況下，使用使用峰高計(jì)算更為合適。

單點(diǎn)校正時(shí)，使用兩次標(biāo)準(zhǔn)樣的平均值。當(dāng)單點(diǎn)校正不能被接受的時(shí)候，可以使用其它的方法。特別是當(dāng)分析很少量的樣品時(shí)，可使用三點(diǎn)校正。如果三點(diǎn)校正是線性的并且通過零點(diǎn)，那么微量的樣品也能很準(zhǔn)確地測量出來。

應(yīng)該使用已知組份的樣品作為參比樣，或者使用其它已經(jīng)有校正曲線的樣品作為參比樣。對于Na-和Ca-柱，最好使用甜菜堿LQD樣品。測定參比樣的純度時(shí)至少要有6個(gè)平行樣品，最后取平均值。對于Pb-柱，使用甘油作為參比樣。

請使用控制表來監(jiān)測分析結(jié)果。在最初的6次運(yùn)行時(shí)，測定結(jié)果的最大偏差不應(yīng)該超過2倍標(biāo)準(zhǔn)差(2×std)。系統(tǒng)的誤差也需要控制在一定的范圍內(nèi)，比如可以通過將標(biāo)準(zhǔn)液作為樣品在最后的時(shí)候測試分析，允許的最大偏差為0.5%單位（即測定結(jié)果為100%±0.5%）。

處理樣品（常規(guī)最佳處理方式）通常使用Na-柱。對于Na-／Ca-柱，單點(diǎn)校正時(shí)進(jìn)樣兩次，取平均值。如果樣品中甜菜堿含量較高，請使用甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)樣；如果認(rèn)為樣品中蔗糖含量較高，請使用蔗糖標(biāo)準(zhǔn)樣。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣跑完柱子以后，立刻注入?yún)⒈葮硬⑶掖_保結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)（使用控制表）。當(dāng)分析6個(gè)樣品后，要棄掉舊的標(biāo)準(zhǔn)曲線并重新制作（2×std，參比樣，處理樣品）。

結(jié)晶產(chǎn)品、芬菜堿LQD和甜菜糖漿通常也是適用于Na-柱分析。對于Na-／Ca-柱，單點(diǎn)校正時(shí)進(jìn)樣兩次，取平均值。使用甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)樣或者含甜菜堿的標(biāo)準(zhǔn)樣作為單一組分（0.7g/100ml）。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣跑完柱子以后，立刻注入?yún)⒈葮硬⑶掖_保結(jié)果在允許的誤差范圍內(nèi)（使用控制表）。分析2－3個(gè)樣品并且每個(gè)樣品進(jìn)樣兩次。計(jì)算兩次進(jìn)樣的平均值并報(bào)告。在棄用舊的標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)液作為樣品測試兩次以檢測系統(tǒng)的誤差。然后重新開始（2×std，參比樣，2次進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)樣為樣品測兩次）。如果兩次進(jìn)樣的結(jié)果偏差小于0.5%個(gè)單位，參比樣在檢測范圍內(nèi)并且以標(biāo)準(zhǔn)樣為樣品的測定結(jié)果為理論值的100±0.5%，那么測定結(jié)果可以被接受。






結(jié)果
結(jié)果以%/自然重量或者%/干物質(zhì)（用含水量校正）表示。

計(jì)算

結(jié)果由下面的公式計(jì)算得出

C(X)=	100×A×100	%/dm
	m(樣品)×dm
C(X)=	100×A	%/nw
	m(樣品)
C(X)=	樣品中甜菜堿的含量，以%/dm或者%/nw來表示
A=	集樣器給出的濃度，以mg/ml為單位
m(樣品)=	樣品重量，以毫克（mg）為單位
dm=	干物質(zhì)
nw=	自然重量

誤差來源
如果管線的清洗不夠充分、管線或柱子中粘有結(jié)塊，那么在色譜中會出現(xiàn)未知峰或者當(dāng)僅僅注入蒸餾水的時(shí)候也會在色譜中出現(xiàn)峰。請沖洗管線和柱子并且使柱子再生。

保留時(shí)間的少許變化是可以接受的，但是如果保留時(shí)間的變化太大的話，柱子的離子形式可能會改變。請清洗系統(tǒng)并且使柱子再生。

如果峰的形狀在變化并且離散度變得很差的話，請更換柱子或者使柱子再生并且重新清洗系統(tǒng)。

可以通過注射0.2M NaOH 1～5次（20～50ul）的方法使柱子快速再生。

每次清洗完柱子以后請確保系統(tǒng)中沒有空氣，盡管做起來會比較困難。可以通過操作自動進(jìn)樣器的OQ測試來檢測系統(tǒng)中是否有空氣。

如果結(jié)果不可靠，請檢查是否所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品已經(jīng)完全充分溶解稀釋。標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液在定容以前先經(jīng)過超聲波處理也許是必要的。

linlejun

蛋雞飼料添加的量比較大些，具體的效果應(yīng)該還不好說吧！

linlejun 于 2009-8-10 10:00 補(bǔ)充以下內(nèi)容

蛋雞飼料添加的量比較大些，具體的效果應(yīng)該還不好說吧！

xinjiang102

本人正在做甜菜堿含量檢測方面的一些研究,可以加我QQ:642463137 一起討論一下.

wycheng_2002

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