飼料中沙門氏菌的檢測(cè)方法

蘇明

求助：飼料中沙門氏菌的檢測(cè)方法（最好有WORD電子版），謝謝

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沙門氏菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展
　畜禽飼用含有沙門氏菌的飼料，如果菌量達(dá)到一定數(shù)目，就可引起疾病或帶菌，因此準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)飼料中的沙門氏菌，對(duì)于防止畜禽和人類沙門氏菌污染具有十分重要的意義。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測(cè)方法，由于其檢測(cè)周期長(zhǎng)、漏檢率高、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)要求。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們已創(chuàng)建了不少快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感、低耗且適用的沙門氏菌檢測(cè)方法。   
　　1  對(duì)傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法的改進(jìn)   
　　由于檢測(cè)沙門氏菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)基選擇性和特異性不能達(dá)到今人滿意的效果，沙門氏菌在飼料中的檢出率又較低，而檸檬酸菌屬、變形桿菌等均可能對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，因此傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法需不斷改進(jìn)，其改進(jìn)內(nèi)容主要集中在選擇性培養(yǎng)基的選擇上。如由于沙門氏菌具有可特異性地分解丙烯乙二醇產(chǎn)酸，使中性紅指示劑變紅的生化特征，在分離培養(yǎng)基中加入丙烯乙二醇、5一溴一4-氯-3一吲哚一β-D呋喃半乳糖，可實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的分離與鑒定工作同步進(jìn)行，使沙門氏菌檢測(cè)所需時(shí)間從常規(guī)方法的 4～6 d縮短至2 d；采用Salmosyst培養(yǎng)基進(jìn)行增菌后，在Rambach培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，可及用對(duì)沙門氏菌的快速檢測(cè)，大大減少了檢測(cè)中所需培養(yǎng)基種類，同時(shí)培養(yǎng)過(guò)程全部在37℃下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便；采用Salmosyst增菌液，對(duì)熱傷害沙門氏菌環(huán)恢復(fù)效果，比常規(guī)檢測(cè)方法中采用緩沖蛋白胨水和四硫磺酸鹽煌綠增菌液更好，使檢測(cè)靈敏度得到較大的提高。   
　　2  快速酶觸反應(yīng)及代謝產(chǎn)物的檢測(cè)   
　　快速酶觸反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在其生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，將它們配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中。根據(jù)細(xì)菌反應(yīng)后出現(xiàn)的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果有助于細(xì)菌的快速診斷。這種技術(shù)將傳統(tǒng)的細(xì)菌分離與生化反應(yīng)有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，并使得檢測(cè)結(jié)果直觀，成為今后微生物檢測(cè)發(fā)展的一個(gè)重要發(fā)展方向。據(jù)Manafi等報(bào)道，沙門氏菌屬（包括各亞屬）均產(chǎn)生辛酯酶，這一性能是腸桿菌科除沙雷氏菌屬外其它各屬細(xì)菌所不具備的，因此可用來(lái)鑒別沙門氏菌與腸桿菌科其它屬細(xì)菌。近來(lái)，Aguirre,Ruiz,Manafi，F(xiàn)reydiere等用意大利Biolife公司的試劑“MUCAP Test”測(cè)試腸桿菌科細(xì)菌、假單胞菌屬、氣單胞菌屬和類志賀氏鄰單胞菌，證明該法對(duì)沙門氏菌有很高的敏感性和特異性，操作也十分簡(jiǎn)便、快速。中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN 0332－94即為用4-甲基傘形酮辛酯（MUCAP）試劑對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢驗(yàn)的方法。   
　　3  免疫學(xué)方法檢測(cè)沙門氏菌抗原或抗體的技術(shù)   
　　3．l  抗血清凝集技術(shù)   
　　早在1933年，Lancefield就成功地用多價(jià)血清對(duì)鏈球菌進(jìn)行了血清分型。隨著抗體制備技術(shù)的進(jìn)一步完善，尤其是單克隆抗體的制備，明顯提高了細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)的特異性，可用于沙門氏菌的分型和鑒定，如以沙門氏菌屬特異單抗HRP標(biāo)記抗體為核心試劑直接ELISA試驗(yàn)，為沙門氏菌檢驗(yàn)和診斷提供了新技術(shù)。揚(yáng)州大學(xué)研制兩株針對(duì)沙門氏菌屬共同表位的單抗 CBS和 de7它們與 99％的沙門氏菌屬內(nèi)不同血清的沙門氏菌反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，建立了直接的ELISA方法，并構(gòu)建了沙門氏菌快速檢測(cè)試劑盒。   
　　3．2  乳膠凝集實(shí)驗(yàn)   
　　將特異性的抗體包被在乳膠顆粒上，通過(guò)抗體與相應(yīng)的細(xì)菌抗原結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。通常此法需獲得細(xì)菌純培育物，再將培養(yǎng)物與致敏乳膠反應(yīng)。目前FDA認(rèn)可的產(chǎn)品有Bactigen、Spectate、Microscreen、  Serobact等，見(jiàn)表 l。   
　　3．3  熒光抗體檢測(cè)技術(shù)   
　　用于快速檢測(cè)細(xì)菌的熒光抗體技術(shù)主要有直接法和間接法。直接法是在檢測(cè)樣品上直接滴加已知特異性熒光標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢樣上滴加已知的細(xì)菌特異性抗體，等作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于750份食品樣品的檢測(cè)，結(jié)果表明，與常規(guī)培養(yǎng)法符合率基本一致   
　　3．4  酶聯(lián)免疫測(cè)試技術(shù)   
　　酶聯(lián)免疫技術(shù)應(yīng)用，大大提高了檢測(cè)的敏感性和特異性，現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用在沙門氏菌的檢驗(yàn)，如Salmonella－TEK、 TECRA、 BacTrce、 Assurance、EQUATE等，見(jiàn)表1。應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)制造的mini-Vidas全自動(dòng)免疫分析儀，是用熒光分析技術(shù)通過(guò)固相吸附器，用已知抗體來(lái)捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過(guò)激發(fā)光源檢測(cè)，即能自動(dòng)讀出發(fā)光的陽(yáng)性標(biāo)本，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高，速度快，可以在48 h的時(shí)間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌。   
　　4  聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)   
　　PCR技術(shù)原理為提高DNA探針的敏感性，可先將靶 DNA序列擴(kuò)增，增加 DNA數(shù)量，使其達(dá)到足夠的檢測(cè)量，若反應(yīng)以動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)，則能定量分析。1983年 Millus和 Cetus發(fā)明了最基本的擴(kuò)增 DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數(shù)量的方法-聚合酶鏈反應(yīng)即PCR法。PCR法建立在三步重復(fù)發(fā)生反應(yīng)的基礎(chǔ)上。①通過(guò)熱處理將雙股DNA變性裂解成單股DNA；②退火延伸引物至特異性寡核苷酸上；③酶促延伸引物與DNA配對(duì)合成樓板，引物退火，變性DNA片段，引物雜交形成的模板可參與再次反應(yīng)。溶液中核苷酸通過(guò)酶聚合成相互補(bǔ)對(duì)的DNA片段，并能重新裂解成單股DNA成為下次PCR復(fù)制的模板。因此每次循環(huán)特異性DNA將以雙倍量增加。典型擴(kuò)增經(jīng)過(guò)20～40次循環(huán)能引起100萬(wàn)倍的擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)中引人Taq聚合酶使反應(yīng)得以半自動(dòng)化和簡(jiǎn)便反應(yīng)程序。用擴(kuò)增DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)具有無(wú)與倫比的優(yōu)越性。   
　　 由于沙門氏菌血清型特別繁多（目前世界上已分離出近2 000多個(gè)血清型，我國(guó)也已發(fā)現(xiàn)了近百個(gè)血清型），因此，對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)往往不能準(zhǔn)確和靈敏，而 Xiaoming Li（2000），CAROLA  BURTSCHER（1999）， Kapley A．（2000）等利用 PCR技術(shù)卻能準(zhǔn)確地檢測(cè)出微量的沙門氏菌。   
　　5  核酸探針（Nuclear acid Probe）的應(yīng)用   
　　5．l  核酸探針   
　　 將已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法標(biāo)記，加入已變性的被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙鏈，從而達(dá)到鑒定樣品中DNA的目的，這種能認(rèn)識(shí)到特異性核苷酸序列有標(biāo)記的單鏈DNA分子核酸探針或基因探針。   
　　5．2核酸探針的類型   
　　根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分成DNA探針或RNA探針，一般大多選用DNA探針；根據(jù)選用基因的不同分成兩種，一種探針能向微生物中全部DNA分子中的一部分發(fā)生反應(yīng)，它對(duì)某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA發(fā)生雜交反應(yīng)，如編碼致病性的基因組，它對(duì)某種微生物中的一種菌株或僅對(duì)微生物中某一菌屬有特異性。這類探針檢測(cè)的基因相當(dāng)保守，包括大部分rRNA，因?yàn)樗瓤赡茉谝环N微生物中出現(xiàn)，又可代表一群微生物。   
　　5．3  探針檢測(cè)技術(shù)中存在的問(wèn)題   
　　 檢測(cè)一種菌就需要制備一種探針，目前尚未建立所有致病菌的探針，盡管檢測(cè)速度快，但要達(dá)到檢測(cè)量還要對(duì)樣品進(jìn)行一定時(shí)間的培養(yǎng)，任何一種方法不可能有 100％的特異性和敏感性，所以必須考慮假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題。   
　　沙門氏菌污染量小，常受應(yīng)激損傷，不易恢復(fù)，現(xiàn)用檢測(cè)方法得到陰性報(bào)告最少需4d陽(yáng)性報(bào)告還要延遲2～3d。研究檢測(cè)沙門氏菌的探針難度大，因?yàn)樗鼡碛? 000多個(gè)血清型， Fillal等人從染色體序列和構(gòu)建的質(zhì)粒文庫(kù)中分離到一個(gè)適用于沙門氏菌檢測(cè)的探針。它能和沙門氏菌而不和其他微生物及樣品培養(yǎng)基發(fā)生非特異性反應(yīng)。這種用同位素標(biāo)記的探針，能識(shí)別350株不同的沙門氏菌。由于該方法最小檢出量只有 1個(gè)細(xì)菌／25 g樣品，所以需要增菌培養(yǎng)。   
　　AOAC最近認(rèn)可了Gene－Trak沙門氏菌比色分析法，見(jiàn)表1。這種探針標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素（FITC），再用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記抗FITC的抗體結(jié)合放大探針，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上雜交，對(duì)239株沙門氏菌的特異性檢出率為 100％，假陽(yáng)性率為 0．8％。   
表1  美國(guó)FDA認(rèn)可使用的沙門氏菌檢測(cè)系統(tǒng)和試劑盒   
類別              商品名稱          分析手段   
沙門氏菌     Automicrobic,GNI       生化試驗(yàn)   
               
自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)            
核酸雜交分析     GENE-TRAK           同位素   
                GENE-TRAK           比色法   
   
免疫分析         Bactigen             LA   
                Spectate             LA   
              Microscreen            LA   
                Wellcolex            LA   
                Serobact             LA   
                                     LA   
                1-2 Test       Immuno-Diffusion   
                PATH-STIK        Dipstick-EIA   
             Salmonella-TEK          EIA   
                  TECRA              EIA   
                  Unique         Dipstick-EIA   
             Salmonella-TEK          EIA   
                  TECRA              EIA   
                  Unique         Dipstick-EIA   
                 EQUATE              EIA   
                BacTrace             EIA   
               Assurance             EIA   
                Isogrid              HGMF   
其它商品化        OSRT           Medium/motility   
快速檢測(cè)方法    Rambach              Medium   
和培養(yǎng)基         MUCAP            C8,Esterase   
                XLT-4               Medium   

　　注：EIA，酶免疫分析；LA，乳膠凝集；HGMF疏水格柵濾膜；MUCAP，4-甲基傘形酮酮辛酯（4-Methylumbelifefylcaprylate）。   
　　6  沙門氏菌檢測(cè)儀器及自動(dòng)化系統(tǒng)   
　　近年來(lái)，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)病原微生物的鑒定技術(shù)朝著微量化、系列化、自動(dòng)化的方向發(fā)展，從而開(kāi)辟了微生物檢測(cè)與鑒定的新領(lǐng)域。最有代表性的是AMS微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)，見(jiàn)表1。   
　　AMS為美國(guó)VITEK廠產(chǎn)品，屬于自動(dòng)化程度高的儀器，由7個(gè)部件組成應(yīng)用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片進(jìn)行測(cè)試，卡片含有干燥的抗菌藥物和生化基質(zhì)，可用于不同的用途，卡片用后可棄去。   
　　操作時(shí)，先制備一定濃度的欲鑒定菌株的菌懸液，然后將菌懸液接種到各種細(xì)菌的小卡上，將其放入具有讀數(shù)功能的孵箱內(nèi)，每隔一定時(shí)間，儀器會(huì)自動(dòng)檢測(cè)培養(yǎng)基的發(fā)酵情況，并換算成能被計(jì)算機(jī)所接受的生物編碼。最后由計(jì)算機(jī)判定，打印出鑒定結(jié)果。   
　　該套系統(tǒng)檢測(cè)卡片為14種，每一種鑒定卡片要含有25種以上的生化反應(yīng)指標(biāo)，基本同常規(guī)檢測(cè)鑒定，檢測(cè)所需時(shí)間最長(zhǎng)不超過(guò) 20 h。   
　　7  其它沙門氏菌檢測(cè)方法   
　　ISO－GRID檢測(cè)系統(tǒng)（表1）是一種基于疏水性網(wǎng)膜（HGMF）的過(guò)濾系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)使用這種含有1600個(gè)小方格的濾膜，來(lái)對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)或計(jì)數(shù)。   
　　首先，稀釋的樣品通過(guò)5 um的不銹鋼預(yù)過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾掉可能引起微生物分析誤差的樣品殘?jiān)w粒。   
　　然后，樣品通過(guò)流水的濾膜過(guò)濾。再將濾膜放在特異性的瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)，以檢測(cè)目標(biāo)微生物。培養(yǎng)完成后，在膜上檢測(cè)目標(biāo)微生物，并記錄陽(yáng)性區(qū)域的數(shù)量。   
　　濾膜不會(huì)染上瓊脂培養(yǎng)基的顏色，從而很容易地區(qū)別微生物，并進(jìn)行鑒別和記數(shù)。此方法快速簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，而且，除沙門氏菌外，還適用于大腸桿菌O157﹕H7、酵母、霉菌、大腸菌群及大腸桿菌的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。