甜菜堿藥物分析進展

wlei908

甜菜堿藥物分析進展

關鍵詞】
甜菜堿
提取分離
定量
高效液相色譜法

甜菜堿（betaine，Bet）又名甘氨酸甜菜堿、甜菜素，化學名稱是三甲基氨基乙酸或三甲銨乙內酯，19世紀最早發現于歐洲，是一種季銨型水溶性生物堿，廣泛存在于動植物和微生物體內。其分子式為C5H11NO2，結構式為（CH3）3N+CH2COO?，外觀物理形狀呈流動性，為鱗狀或棱狀白色結晶，易溶于水和甲醇，由于常溫時極易吸濕潮解，應用時常將其制成甜菜堿鹽酸鹽（鹽酸甜菜堿）。自上世紀70年代以來，甜菜堿的研究漸成熱點，已被廣泛應用于畜牧、醫藥、農林、食品和日化等領域。特別是在醫藥領域，甜菜堿許多優良的藥理作用被相繼發現，可用于對抗高同型半胱氨酸綜合癥，能保肝護腎、保持心臟與血管健康、維護消化系統、抑瘤抗癌、降壓鎮靜、解熱鎮痛、耐缺氧、保護細胞抵抗高滲等等。體內組織或排泄物中甜菜堿的測定有助于臨床上診斷人體內代謝異常與否［1］，許多甜菜堿藥效研究需要對其進行治療藥物監測，這都涉及到甜菜堿的分析測定。如何更準確、簡單、快速、經濟地從生物樣品中分離并定量甜菜堿，一直是學者們努力的方向。

    1   從生物樣品中提取分離甜菜堿

基于甜菜堿的溶解性特點，從生物樣品中提取甜菜堿最常用的方法有水提和醇提兩種，如Hitz和Hanson［2］將生物樣品90℃水浴1h，冷卻后研磨，2 ℃去離子水浸提共3次，最后65 ℃減壓濃縮；最早提出提取甜菜堿方法的Pearce等［3］使用甲醇對生物樣品反復提取3次，然后于65 ℃減壓濃縮。國內有用堿性三氯甲烷提取甜菜堿的報道［4］,樸茨茅斯大學的楊昕等［5］則采用了混合提取法，將甲醇?氯仿?0.2 mol·L?1碳酸氫鉀（12：5：1 v/v）加入生物樣品，60 ℃分別提取2次，然后用甲醇?水（1：1 v/v）60 ℃加熱提取，取得較好效果。

基于甜菜堿的兩性季銨型生物堿的特殊結構，對其分離純化大多使用離子交換法。該方法是利用離子交換劑上的可交換離子與周圍介質中被分離的各種離子間的親和力不同,經過交換平衡達到分離目的的一種柱色譜法［6］。Horst［7］、劉新亞等［8］、尹昆等［9］分離提純甜菜堿均使用了此類方法，都是將提取液依次通過強堿性陰離子交換樹脂、強酸性陽離子交換樹脂，最后用氫氧化銨洗脫。此法能除去提取液中的氨基酸、蛋白質、多糖和苷類等成分，最終使測量結果準確可靠。吳志榮［10］、楊東輝［11］則利用了薄層層析法來分離純化甜菜堿，但如何選擇優良的展開劑、顯色劑仍是制約該法的一個瓶頸。另外谷大建等［12］采用Oasis HLB固相萃取小柱對樣品進行純化，得到較好的效果。

    2  甜菜堿定量分析方法

對于甜菜堿的定量測定，自Pearce等發布碘量法［3］以來，又出現了可見一紫外分光光度法［13?14］、薄層掃描法［15］、非水滴定法［16］等許多分析方法，目前的主流方法是高效液相色譜（HPLC）法。

    2.1  高效液相色譜（HPLC）法

該法準確、快速，再現性高，可連續進樣，能滿足體內藥物分析大樣本快速分析要求。根據選用色譜柱、檢測器種類及是否對甜菜堿進行衍生化，目前HPLC法大致分為以下幾種方案。

    2.1.1  反相C18柱?紫外檢測器?直接測定

陳少良等［17］在測定甜菜堿時采用的流動相為50 mmol·L?1KH2PO4(pH4.45)和0.1%PIC B_8(辛烷磺酸)，流速0.7 ml·min?1,檢測波長為192 nm，測得甜菜堿的保留時間為6.3 min,加樣回收率達到90 %左右；尹昆等［9］、谷大建等［12］均采用類似的方法，測得甜菜堿保留時間分別為2.5 min、4.01 min，加樣回收率在90%以上。

    2.1.2  LC?SCX、CLC?ODS柱?紫外檢測器?甜菜堿衍生化后測定

基于甜菜堿在近紫外區測定干擾大，保留時間短的特點，人們采用先將其衍生化再測定的方法。Laryea等采用［18］?冠醚?6及4?溴代苯甲酰甲基溴作為衍生試劑與樣品和KH2PO4混勻后80 ℃加熱60 min，制得甜菜堿的衍生物，使用強酸性陰離子交換色譜柱（LC?SCX），流動相為乙腈?水（90：10 v/v），10 mmol·L?1膽堿，流速1.5 ml·min?1,檢測波長為254nm來測定血樣和尿樣中的甜菜堿含量，發現衍生物保留時間為14.8 min，檢測最低限為5 μmol·L?1，效果良好。Lever等［19］、Mar MH等［20］亦采用這種方法對甜菜堿進行了成功檢測。許明旺等［21］則采用了18?冠醚?6及2，4?溴代苯甲酰甲基溴作為衍生試劑，使用CLC?ODS色譜柱，流動相為乙腈?水(35：65,其中含有0.1 mol/L的NaClO4),流速1 ml·min?1,檢測波長254 nm，測得衍生物保留時間為13 min，加樣回收率在95%以上。姚少威等［22］采用相同的方法檢測了復方枸杞顆粒中的甜菜堿含量，加樣回收率亦在95%以上。

    2.1.3  胺基柱?紫外檢測器?直接測定

廖國玲等［23］采用Lichrospher NH2色譜柱，以乙腈?水(85：15 v/v)為流動相，流速0.7 ml·min?1，檢測波長195 nm，測定枸杞中甜菜堿，保留時間為16.58 min，平均回收率為98.9%，方法較為簡單，重現性好。

    2.1.4  胺基柱?蒸發光檢測器?直接測定

基于甜菜堿在近紫外區測定干擾大的特點，龔立冬等［24］使用蒸發光檢測器代替紫外檢測器，采用Waters Spherisorb S5 NH2色譜柱，流動相為0.1％(體積分數)三氟乙酸水溶液?甲醇(l5：85 v/v)，流速為0.6 ml·min?1，蒸發光散射檢測器中漂移管溫度90 ℃，測定肉蓯蓉中的甜菜堿，加樣回收率達到99%以上。李向陽等［4］也采用胺基柱、蒸發光檢測器，流動相為乙腈?水(25：75 v/v)，流速1.0 ml·min?1，漂移管溫度50 ℃，進行甜菜堿含量測定，加樣回收率在97%以上。

    2.2  其他分析方法

    2.2.1  可見一紫外分光光度法

這種方法應用較早，主要利用樣品與顯色劑發生顯色反應而生成有色物質，以便使用分光光度計進行測定。Barak等［13?14］處理后的肝組織樣品與冷卻的KH2混合產生碘化物沉淀，離心后用二氯乙烷溶解沉淀，在365 nm處測定吸光度，通過工作曲線計算出了甜菜堿含量。但該法干擾因素較多，特別是在測定低含量樣品時誤差較大。

    2.2.2  薄層掃描法

郭輝等［15］用0.5%羧甲基纖維素鈉的硅膠G薄層板,以氯仿?甲醇?甲酸?水(2：8：2.2：0.5)為展開劑，以改良碘化泌鉀溶液為顯色劑，掃描波長為498 nm，對肝腎滋中的甜菜堿含量進行了測定。其最低檢出限為22.8 μg，加樣回收率在95 %以上。由于操作中難以保持展開溫度、展開劑極性及蒸氣壓等諸多條件的恒定，該法重現性并不是很理想。

    2.2.3  非水滴定法

這是一種經濟簡便的測定方法，齊永秀等［16］以冰醋酸作為溶媒,以結晶紫作為指示劑,使用0.1 mol·L?1標準高氯酸溶液滴定并考察了不同廠家生產的鹽酸甜菜堿的純度，平均回收率為99.81%,相對標準偏差(RSD)為0.19%。該法穩定性及重現性較好，但無法滿足大樣本連續分析的要求。

    2.2.4  微型電極法

國外學者［25］曾用此法測定了甲基胺混合物中甜菜堿的含量。該法以甘汞電極為參比電極,玻璃微型電極為測定電極,用雙靜電計記錄電壓的方法測定甜菜堿含量,具有響應快、靈敏度高的特點，但前處理過程麻煩，也無法滿足大樣本連續分析的要求。

    2.2.5  質譜法與核磁共振法

質譜法通常與氣相色譜儀或液相色譜儀聯用來達到理想分離與精密測定的效果。Holm等［26］使用這種方法對血漿中的甜菜堿、膽堿、二甲基甘氨酸進行了測定。國外學者還利用1H NMR法測定了病人尿樣中的甜菜堿［27］。不可否認這兩種方法具有較高的精確性與靈敏度，但儀器較為昂貴，難以在大范圍內推廣。

    3  小
結

對甜菜堿的提取分離應結合具體生物樣品及檢測手段，隨著檢測手段的改進，提取分離也將趨向簡單化、自動化。提取一般使用水、甲醇，而分離純化一般使用離子交換樹脂法，更為簡單的SPE(固相萃取)法也將得到廣泛應用。對甜菜堿進行測定一般使用HPLC法。基于甜菜堿的強極性特點，分析柱的選擇越來越傾向于使用胺基柱，它能克服甜菜堿保留時間短，干擾大的缺點；對于僅配有紫外檢測器的實驗室來講，從檢測效果看衍生化法具有一定優勢，國外尤為盛行，但操作復雜；如若克服使用近紫外檢測干擾大的缺點，蒸發光檢測器不失為一種良好選擇。一般實驗室如處理樣品樣本量少、對自動化要求不高，則非水滴定法、微型電極法可滿足條件，且靈敏度較為理想。

secwind

好資料，謝謝LZ

波縱天下

東西已經分析到實質了。