谷氨酰胺對動物腸道抗氧化能力的影響

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　　腸道是動物重要的吸收消化器官,對生長性能和機體健康起著十分重要的作用。由于腸道不斷的暴露于各種外源物質中,因此也極容易產生各種應激反應,損害腸道的正常生理功能。自從Windmueller做了一系列關于非必需氨基酸在小腸中的重要代謝作用研究后，谷氨酰胺(Glutamine,Gln)對腸粘膜功能的重要支持作用被廣泛接受。谷氨酰胺在動物體內含量非常豐富,約占總游離氨基酸的25%,是機體合成氨基酸、蛋白質、核酸和多種生物活性物質的前體。在成鼠、仔豬中,有20%~30%的循環Gln是被小腸攝取的。Gln被認為是快速生長的腸細胞中最重要的能量來源。在各種應激條件下Gln能提高腸道抵抗應激的能力,維持腸道的正常結構和功能。而近來年研究發現,Gln對腸道的保護作用與其對腸道抗氧化能力的影響有關。
　　1 機體的氧化和抗氧化系統
　　在機體中，氧化劑和抗氧化劑之間的平衡是嚴格調節的，因為這種平衡對維持生物大分子和細胞的功能十分重要。對平衡的任何干擾都會引起對細胞和組織的毒害。當氧化劑的增加超過了抗氧化劑的清除能力時就被定義為氧化應激，導致氧化損傷。通常氧化劑是指活性氧簇（ROS）,它可分為自由基和非自由基。自由基都至少含有一對未成對電子，這對未成對電子易于得到或失去電子以維持穩定性，因此自由基的活性十分高。非自由基包括了許多物質，其中的一些活性非常高，但從定義上來說卻不是自由基。ROS的來源包括外源性的和內源性的。外源的包括輻射、空氣污染物、藥物、食品。雖然外源產生的ROS很高，但是內源來源的更重要，因為它能在機體的細胞生命周期中不斷產生。線粒體ATP的產生過程中，氧氣接受4個電子被還原成水。在這個過程中可形成一些主要的氧衍生物，ROS可從線粒體中泄漏到細胞內環境中。酶組成了內源ROS的另一個來源，ROS是大多數酶的副產物，如黃嘌呤氧化酶能產生超氧陰離子，還有一些酶的主要功能就是產生ROS，如產生NO的一氧化氮合酶。ROS的不斷流出引起細胞成分的連續性和積累性的氧化損傷，從而改變細胞功能。
由于不停的暴露在氧化應激中，促使細胞和整個機體形成了一套抗氧化的防御機制。在不同的防御機制中，抗氧化劑尤其重要，因為它能直接清除氧化劑?？寡趸到y主要包括2種類型：抗氧化酶和小分子抗氧化劑。抗氧化酶主要是超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）。小分子抗氧劑主要有谷胱甘肽（GSH）、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素等。
　　2 Gln對腸道抗氧化能力的影響
　　2．1 Gln對應激時腸道結構和功能的保護作用
　　腸粘膜的正常結構與功能是營養物質充分消化與吸收的基本保證，因此維持小腸結構與功能是提高養分消化利用和促進動物生長的重要營養生理基礎。應激對動物腸粘膜形態有很大影響，表現為小腸粘膜絨毛高度下降、隱窩加深、腸絨毛成熟細胞數量減少等。輻射損傷的大鼠絨毛細胞的數量只有3.6個/mm，絨毛高度為0.150 mm， 用Gln預處理后，細胞數量增加到7.9個/mm，絨毛的高度也提高到0.398 mm。鄭善軍（2007）用掃描電鏡觀察Gln對輻射損傷的大鼠腸粘膜的保護作用，結果表明輻射組絨毛雜亂、窄小，排列無規律，絨毛頂端有明顯潰爛，發生潰瘍的絨毛數目較多，而補充Gln組動物腸粘膜絨毛寬大、鈍圓， 接近正常對照組的形態,排列整齊, 絨毛頂端形成細小潰瘍，但潰瘍發生不普遍。
Gln還可以保護腸道正常的吸收和消化功能。Gln可以恢復小腸缺血再灌注(I/R)損傷的人腸上皮細胞的Gln、Glu和Leu轉運受阻。Alteheld(2005)用過氧化氫誘導Caco-2細胞產生氧化應激后,細胞中PepT1載體介導的二肽轉運被抑制。用Gln二肽處理后可顯著增加二肽的轉運。Gln還能抑制由手術氧化應激引起的離體腸刷狀緣的葡萄糖轉運降低。可見Gln恢復了腸道氧化應激引起的營養物質的轉運受阻。腸道的消化功能可由腸細胞分泌的消化酶活力來反映。目前關于Gln對腸道消化功能的保護作用僅有少量研究。張軍民(2001)報道,在日糧中添加Gln后,斷奶仔豬35日齡十二指腸中亮氨酸氨基肽酶的活性是對照組的1.5倍。楊彩梅(2006)報道仔豬斷奶后7 d,Gln組和Gly-Gln組蔗糖酶活性分別比對照組提高54.90%和60.41%，麥芽糖酶活性比對照組提高45.87%和38.60%。
　　2.2 Gln能抑制腸細胞的死亡
　　氧化應激能使腸細胞生長抑制或死亡，Gln能抑制小腸粘膜細胞的死亡。Wischmeyer(1997)用氯乙烷誘導了大鼠腸上皮細胞的氧化應激，當Gln濃度大于4 mmol/l時能顯著降低氯乙烷引起的細胞死亡。方天翔（2003）試驗結果表明，輸注Gln后使缺血再灌注的小腸絨毛和隱窩細胞的凋亡數量顯著降低。Evans（2003）的研究表明，Gln能劑量依賴的抑制大鼠結腸上皮細胞凋亡；并且Gln抑制細胞凋亡的作用是特異性的，Glu或Cys、Gly都沒有這個作用。凋亡是細胞主動參與自身死亡的過程。細胞凋亡的途徑主要有兩條，一條途徑是通過細胞外死亡受體激活細胞內的凋亡酶半胱氨酸特異性蛋白酶(caspase-8)；另一條途徑是通過改變線粒體外膜通透性使多種促細胞凋亡因子從線粒體內外膜間隙釋放到胞質，從而激活caspase-9。兩條通路最終都通過激活caspase-3(共同通路)進入細胞凋亡的執行階段，引起細胞凋亡。經研究發現，Gln可增強小腸粘膜細胞中Bcl-2的表達，說明Bcl-2參與Gln抑制腸粘膜細胞凋亡的保護機制。Bcl-2可抑制小腸上皮細胞凋亡。在細胞凋亡誘導期，線粒體釋放細胞色素c，促使Apaf-1激活caspase-9, Bcl-2則抑制細胞色素c的釋放，阻礙Apaf-1 與效應分子的結合, 阻斷凋亡的聯級反應。Gln除了可以影響線粒體凋亡通路外，還可以直接影響caspase-3的活性。Erbil（2005）給輻射損傷的大鼠飼喂Gln后,小腸中caspase-3的活性降低了約60%。Gln還完全抑制了大鼠結腸上皮細胞caspase-3活性的增加。當Gln的代謝關鍵酶谷氨酰胺酶的表達被抑制后,caspase-3的活性是正常細胞的1.5倍。以上結果均表明Gln可抑制caspase-3的活性,從而減少腸細胞凋亡。
　　2.3 Gln對生物大分子損傷的保護作用
　　在分子水平上，ROS主要引起脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷。MDA是脂質過氧化的終產物，測定其含量能直接反映細胞膜被氧化的程度，因此常用它來衡量細胞氧化應激的損傷程度。大鼠回腸缺血再灌注4 h后MDA的濃度為743.84 nmol/g，而Gln能使MDA的濃度降至354.55 nmol/g。戴定威（1999）研究了Gln對缺氧復氧損傷的人小腸細胞MDA含量的影響表明，預先應用Gln處理組MDA水平顯著低于缺氧復氧組。Gln還能顯著降低放射性損傷、手術、抗炎藥引起的大鼠腸組織氧化應激時MDA濃度的增高。Gln還可以保護蛋白質免受氧化損傷。蛋白質羰基由蛋白質側鏈氨基酸殘基氧化后產生，通過測定羰基含量可判斷蛋白質是否被氧化損傷。研究發現在大鼠的腸組織勻漿、刷狀緣膜、線粒體中Gln能降低氧化應激誘導的蛋白羰基含量的增加。
　　3 Gln提高腸道抗氧化能力的可能作用方式
　　3.1 Gln對 GSH合成的影響
　　Gln對機體的抗氧化能力的增強可能與其能參與谷胱甘肽(GSH)的合成，增加GSH的含量有關。GSH是含量最多的低分子巰基化合物（0.5~10 mmol/l），為一種重要的低分子抗氧化劑。GSH在抗氧化應激中的主要作用有：①GSH是多種抗氧化酶，如GPx、谷胱甘肽轉移酶的輔酶，參與其酶促反應；②GSH直接清除羥自由基和單線態氧，防止ROS對機體產生的氧化損傷；③GSH可參與氨基酸的轉運；④GSH能使維生素C和維生素E轉變為活性形式。大量研究表明，Gln在正常的生理條件或應激時都可以維持腸道內正常的GSH水平，從而在氧化應激時保護細胞的正常結構和功能。此外，Gln還可以提高肝臟、胰腺、胰腺β細胞、肺細胞、單核細胞等組織和細胞中的GSH含量?？梢姡珿ln能廣泛地提高機體組織中GSH的含量。Gln可通過谷氨酰胺酶分解成谷氨酸(Glu)，谷氨酸作為GSH的組成氨基酸，提高了GSH的合成。生理pH值條件下Gln是電中性的，谷氨酸則帶負電荷，因此與Gln相比，Glu更難轉運入細胞內，所以細胞內合成GSH的谷氨酸主要來自Gln。Gln分解產生的Glu除了作為原料合成GSH外，還可以通過阻止GSH對Y－谷氨酰半胱胺合酶的抑制對GSH合成起調節作用。Y－谷氨酰半胱胺合酶是GSH合成的限速酶，GSH能夠反饋抑制Y－谷氨酰半胱胺合酶的活性。Glu可以和GSH競爭結合Y－谷氨酰半胱胺合酶，從而減弱了GSH對Y－谷氨酰半胱胺合酶的抑制作用。當細胞內的Glu濃度異常高時GSH合成會增強。
　　3.2 Gln對其它抗氧化劑的影響
　　在抗氧化防御體系中，各種抗氧化酶從不同角度協助清除體內的ROS，在抗氧化過程中起著不同的作用。SOD可加速超氧陰離子（O2-）發生歧化作用，清除O2-，防止O2-對機體產生的損傷作用。GPx可利用GSH作為底物，還原H2O2和催化幾乎所有的有機氫過氧化物（ROOH）轉變為ROH，減輕對機體的損傷。CAT主要還原H2O2?，F有的研究表明Gln對SOD和GPx的活性有影響。Basivireddy（2004）給大鼠飼喂抗炎藥物后，其組織勻漿的SOD、GPx活性顯著降低，補充Gln后增強了這些酶的活性。Fillmann（2007）用乙酸誘導大鼠結腸炎后，結腸中的GPx活性與正常組相比降低了21%，預飼喂Gln后，GPx的活性恢復到了正常值。斷奶仔豬日糧中添加0.125%和0.25% Gln二肽后，隨添加水平提高，斷奶后第10 d和第21 d血清GPx活性分別以線性或二次曲線方式升高，第10 d和第21 d血清SOD活性均以線性方式升高。高溫下日糧中添加0.5%和0.8% Gln可顯著提高黃羽肉雞的血液GPx活力，對血液SOD活力無顯著影響。
Yeh(2003)給燒傷的大鼠飼喂Gln后，發現肝中的GPx和腎中的SOD 活性顯著降低。張軍民(2002)在日糧中添加1.2%谷氨酰胺后，仔豬35日齡時肝臟和49日齡脾臟中SOD活性均極顯著低于未添加組，他推測在機體的抗氧化系統內可能存在著動態平衡機制，即作為抗氧化系統的抗氧化劑在某種狀況下并非同時增加，而是一種機制激活時，而另一種可能處于被抑制狀態。
從以上的研究中可看出Gln對抗氧化酶活性的研究存在許多不一致的報道，關于Gln對抗氧化酶的影響方式及機制還不清楚，有待進一步研究。
　　3.3 Gln對熱休克蛋白表達的影響
　　Gln能誘導熱休克蛋白的產生。熱休克蛋白(HSP)又稱為應激蛋白，是生物細胞（包括原核細胞及真核細胞）在受熱、生物因素、理化因素等應激原刺激后，發生熱休克反應時所產生的一類在生物進化中最保守并由熱休克基因所編碼的伴隨細胞蛋白。HSP可以增強細胞對氧化損害的耐受程度，維持細胞的正常功能，提高細胞的生存率。Gln主要誘導HSP72和HSP25的表達。Wischmeyer（1997）對腸上皮細胞IEC-18的研究證實，Gln在熱應激、氧化應激及無應激的條件下都能增強HSP70的表達，且呈劑量效應，2～4 mmol/l的Gln就能誘導HSP70的表達，當Gln的濃度為10～15 mmol/l時,HSP70的表達量達到最大值。其它的研究者也報道了相似的研究結果。體內研究也發現，Gln能增強LPS感染的小鼠心臟、肺、結腸和腎中HSP72和HSP25的表達。Gln可能增強了熱休克因子1(HSF-1)的表達,促進HSF-1移位到細胞核中,與HSP基因上的熱休克反應元件結合,從而誘導了HSP的mRNA轉錄。
　　3.4 Gln對NO產生的影響
　　一氧化氮是含有一個未配對電子的小分子,因此它屬于自由基。NO是L-精氨酸氧化產生的。催化這個反應的酶是一氧化氮合酶（NOS),在生理條件下，NO和超氧陰離子反應生成過氧亞硝基鹽(ONOO-)。ONOO－是一種強力氧化劑，能消耗巰基,氧化許多分子,引起的損傷類似于羥自由基。它還能引起DNA斷裂,蛋白氧化和蛋白質芳香族氨基酸的硝化。因此,NO也能對細胞造成氧化損傷。Suha(2003)研究表明小腸缺血再灌注損傷大鼠血漿中NO的濃度為50.55 μmol/l，而Gln組的NO濃度為33.19 μmol/l，進一步研究發現再灌注4 h和8 h后，Gln組iNOS基因的表達都要顯著低于I/R組。 Fillmann（2007）在大鼠的結腸炎模型中發現，誘導性一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白含量是正常大鼠的245%，用Gln預飼喂后，iNOS的蛋白含量顯著降低，只有正常組的87%。對大鼠實施心肺分流術后，靜脈注射Gln后，其心臟、肺臟、肝臟中的iNOS 蛋白含量顯著降低。Gln對iNOS表達的抑制作用可能與其對核因子-κB（NF-κB）的影響有關。iNOS基因的表達受NF-κB 的調控。Gln阻止了NF-κB 抑制蛋白（IκB）激酶表達上調，從而減少了IκB的蛋白水解，降低了NF-κB的p65亞基在細胞核中的表達，阻止NF-κB的活化，從而抑制了iNOS基因的表達。
　　4 結語
　　隨著研究的不斷深入，谷氨酰胺在動物營養中的作用已遠遠超出了傳統的非必需氨基酸的范疇。大量研究結果證明，當動物處于應激或病理狀態時，谷氨酰胺維持了腸道的結構和功能，減少了氧化應激導致的細胞死亡和生物大分子的損傷，其機制之一可能是Gln增強了機體抗氧化系統的清除能力，或是直接抑制了自由基的產生。隨著養殖生產集約化程度的不斷提高，動物抵抗應激的能力變得越來越重要，因此，充分了解谷氨酰胺在動物抗應激中的重要作用，對生產具有重要的指導意義。

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