喹乙醇--------想說愛你不容易

言西早 · 發表于 2010-4-17 10:11:39

[p=30, 2, left][b][font=SimHei][size=15pt]穿梭質粒pSP189/哺乳動物Vero細胞檢測系統在[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘變分子機制研究中的應用[/size][/font][/b][/p][p=30, 2, left]郝利華，肖希龍，周宗燦[/p][p=30, 2, left](1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2.中國農業大學動物醫學院，北京　100094；3.北京大學醫學部，北京　100083)[/p][p=30, 2, left][b][size=12pt]Molecular Mechanism of Mutag-enesis Induced by OlaquindoxUsing a Shuttle Vector pSP189/Mammalian Cell System[/size][/b][/p][p=30, 2, left]HAO Li-hua, XIAO Xi-long,?,ZHOU Zong-can[/p][p=30, 2, left](1.China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081,China;2.Department of Pharmacology and Toxicology, College of Veterinary Medicine,China University of Agricnltwre,Beijing 100094,China; 3.Department of Health Toxicology, College of Medicine, Beijing University, Beijing 100083,China)[/p][p=30, 2, left]　　【摘要】背景與目的：將短暫復制型穿梭質粒pSP189與非洲綠猴腎細胞(Vero細胞系)組成穿梭質粒/哺乳動物細胞誘變檢測系統，并將該系統應用于[b]喹[/b][b]乙醇[/b]的誘變性檢測。材料與方法：質粒經6.6μg·ml－1[b]喹[/b][b]乙醇[/b]處理后，轉染Vero細胞，從細胞中回收質粒轉化E.coli MBM7070指示菌篩選突變體。結果： [b]喹[/b][b]乙醇[/b]處理組的誘變頻率(24×10－4)明顯高于溶劑對照組(1.2×10－4)；試驗進一步對61個突變子中的24個突變子質粒靶基因進行序列分析，發現[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引起質粒靶基因核苷酸序列改變主要表現為點突變和連續缺失，且以引發點突變為主，占總數的70％。點突變主要集中在G:C堿基對，且包含在5'-NNTTNN-3'的序列中，其中的N位易發生突變，主要表現為G:C-T:A或G:C-A:T置換；而缺失以連續缺失為主，包含在含ANGGCCNAAA的序列中。結論： [b]喹[/b][b]乙醇[/b]能誘發質粒pSP189靶基因突變。[/p][p=30, 2, left]　　【關鍵詞】穿梭質粒； Vero細胞；突變； [b]喹[/b][b]乙醇[/b][/p][p=30, 2, left]　　中文分類號： S816.2;R394.6　　　　文獻標識碼： A　　　　文章編號： 1004－616X(2006)01－0023－03[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　【ABSTRACT】 BACKGROUND ＆ AIM: Using a new SV40-based shuttle vector pSP189 and African green monkey kidney cells(Vero E6 cell line)，we constituted a shuttle vector /mammalian cell system to detect mutagenesis in vitro induced by olaquindox. MATERIAL AND METHODS: The vector plasmids were trealed by olaquindox , then transfected into Vero cells. After recovery from cells, the plasmids were transformed into MBM7070 and mutant colonies were selected. The mutation in 24 mutants was determined by dideoxy sequence analysis. RESULTS: The lesion induced by 6.6μg·ml－1 olaqiunxox included a large number of base substitutions, in addition to tandem base deletion. Point mutation frequencies of modified plasmids in vitro were dramatically increased to 70％ the spontaneous background level,and base substitutions concentrated on the G:C base pair, the predominant mutation was G:C-T:A or G:C-A:T. Olaqiundox-induced mutations on the SupF shuttle vector was not distributed randomly, they had mutation hot spots (155bp) and sequence specificity, which were contained in the sequence 5＇-NNTTNN-3＇. Mutation was common in N site,tandem base deletion or rearrangement focused on ANGGCCNAAA sequence. CONCLUSION: Olaquindox could induce plasmid shuttle vector mutagenesis.[/p][p=30, 2, left]　　【KEY WORDS】 shuttle vector; olaquindox; mutagenesis; Vero cells[/p][p=30, 2, left]　　穿梭質粒帶有對突變敏感的靶基因，將誘變劑處理的質粒轉染哺乳動物細胞或先轉染細胞后經誘變劑處理，在細胞內修復和復制后，回收質粒轉化宿主菌，在一定條件下篩選突變子，并進一步對突變子靶基因測序以分析突變的位點、類型、序列特異性等信息，從而研究誘變劑的誘變機制。由于誘變是在哺乳動物細胞內發生的，因而能夠較真實的反映高等動物的誘變機制；且誘變的發生通過宿主菌顯色反應來顯示，其任一位置發生的單堿基置換都能從表型改變表現出來；進一步對突變子靶基因進行序列分析，使表型的改變在DNA分子水平上得到證明，敏感性極高[1]。因此穿梭質粒被廣泛應用于各種誘變劑的誘變性研究[2～4]。[/p][p=30, 2, left]　　[b]喹[/b][b]乙醇[/b]由于其優良的[b]抗菌[/b][b]促[/b][b]生長[/b][b]作用[/b]，在我國被廣泛應用于豬和魚類的飼料添加劑中。[b]喹[/b]　啉類藥物分子結構有很大的相似性，均為[b]喹[/b]叨嗪的衍生物，[b]喹[/b]叨嗪由于其遺傳毒性被禁用 [5]，由此引發人們對這類藥物遺傳毒性的研究[6，7]。試驗證明卡巴氧和[b]喹[/b][b]乙醇[/b]在嚙齒類動物表現出基因毒性和致癌性[8，9]；研究還發現[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引發飼養場工人發生過敏和光敏感性皮炎[10]。鑒于上述原因，歐盟委員會認為[b]喹[/b][b]乙醇[/b]和卡巴氧的休藥期不能確定，其對人體健康存在可能的不良[b]作用[/b]，于1999年1月1日正式撤消[b]喹[/b][b]乙醇[/b]和卡巴氧用作[b]促[/b][b]生長[/b]添加劑[11]。而[b]喹[/b][b]乙醇[/b]在我國仍然作為[b]抗菌[/b][b]促[/b][b]生長[/b]添加劑被廣泛使用，我們用穿梭質粒pSP189/哺乳動物Vero細胞系統研究[b]喹[/b][b]乙醇[/b]的誘變性，探討[b]喹[/b][b]乙醇[/b]對質粒靶基因SupF上[b]作用[/b]的位點、誘變類型及序列特性。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　1　材料與方法[/p][p=30, 2, left]　　1.1　細胞、質粒及其宿主菌　穿梭質粒pSP189及其宿主菌E.Coli MBM7070由美國NIH9900醫學中心Seidman教授贈送。Vero細胞由浙江省醫學科學院病毒病研究所柴少愛副所長惠贈，在含1×105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、10 ％小牛血清的DMEM培養基中常規培養。[/p][p=30, 2, left]　　1.2　試劑[b]　[/b][b]喹乙[/b]醇(含量：99 ％)：中國獸醫藥品監察所；轉染試劑盒Lipofectamine2000、DpnⅠ內切酶promega公司產品；X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、IPTG(異丙基-β-D-半乳糖苷)，Gibco公司產品；其它試劑均為國產和進口分析純。[/p][p=30, 2, left]　　1.3　質粒染毒及轉染　轉染前一天接種5×105個細胞于25 cm2培養瓶中，用不含雙抗的DMEM培養基常規培養使細胞密度達70 ％～90 ％；于細胞體外直接將[b]喹[/b][b]乙醇[/b]以6.6 μg/ml[12]的劑量在37 ℃[b]作用[/b]質粒60 min，形成質粒DNA-[b]喹[/b][b]乙醇[/b]加合物[13]，用高效轉染試劑Lipofectamine2000進行轉染，按說明書操作。轉染細胞在含10％小牛血清的DMEM培養基中常規培養 48～72 h后收獲質粒。[/p][p=30, 2, left]　　1.4　質粒回收　從Vero細胞中回收質粒按Seidman提供的材料操作。[/p][p=30, 2, left]　　1.5　質粒轉化篩選突變體　取2 μl回收的質粒用CaCl2法轉化MBM7070指示菌，在含氨芐西林(100 mg/L)、X-gal(2 ％)和IPTG(20 ％)的LB固體培養基上篩選突變體。藍色菌落為野生型，白色菌落為突變型，用雙脫氧鏈法對突變子質粒靶基因進行序列分析。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　2　結　果[/p][p=30, 2, left]　　2.1　[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發質粒靶基因突變頻率分析　質粒從Vero細胞中回收后，轉化指示菌在含Amp、X-gal、IPTG的LB固體培養基上培養所得轉化子、突變子數以及突變頻率結果見表1。結果表明溶劑對照組獲得的約8496個轉化子中有1個白色的突變子，自發突變頻率為1.2×10－4，而[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發突變頻率為24×10－4，高出溶劑對照近22倍，突變檢出明顯。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　2.2　[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發質粒靶基因突變序列測定結果[/p][p=30, 2, left]　　2.2.1　突變譜[b]　[/b][b]喹乙[/b]醇誘發的61個突變子中所測24個突變子質粒靶基因SupF tRNA核苷酸序列測定結果見圖1，圖中結果顯示[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發質粒靶基因發生點突變、缺失和重組。[/p][p=30, 2, left]　　2.2.2　突變類型、突變位點及突變次數[b]　[/b][b]喹乙[/b]醇誘發的質粒靶基因突變類型、突變位點、突變次數結果見表2。表中結果顯示[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引起質粒靶基因發生點突變、堿基插入、堿基缺失和重組；以誘發點突變為主，點突變集中于155、111和128位點；而缺失發生于108～145 bp，這段序列也可發生堿基重組；172位點發生兩次單堿基插入。[/p][p=30, 2, left]2.2.3　突變的序列特異性　對點突變和缺失及重組的位點進行序列分析，見表3，發現其中3個點突變位點(105、155、164)均包含在 5'-NNTTNN-3'(N為G或C)序列中，而突變發生在N位，由此可見-NNTTNN-序列的N位易發生點突變；而缺失和重組主要發生在含有ANGGCCNAAA的序列中，因此ANGGCCNAAA序列易引起缺失和重組。由此可見[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發質粒靶基因核苷酸序列改變并非隨機而是存在一定的序列特異性。[/p][p=30, 2, left]
[/p][p=30, 2, left]　　3　討　論[/p][p=30, 2, left]　　我們的試驗結果表明[b]喹[/b][b]乙醇[/b]主要引起質粒DNA序列發生缺失和點突變，且突變在靶基因SupF tRNA上的分布是存在著一定的序列特異性。[/p][p=30, 2, left]　　我們試驗結果表明[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發質粒靶基因突變，即[b]喹[/b][b]乙醇[/b]有致基因突變的[b]作用[/b]，與Ames實驗[8]、體外誘變哺乳動物細胞實驗[14]、哺乳動物體內誘變實驗[6，7]等結果一致；而本試驗首次在質粒DNA一級結構上具體論證了[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發突變發生的位點、類型、熱點以及序列特異性信息，從分子水平上闡明了[b]喹[/b][b]乙醇[/b]誘發突變的特征，為[b]喹[/b][b]乙醇[/b]的致突變性提供新的理論依據。[/p][p=30, 2, left]　　質粒和細胞可以用誘變劑分別處理，既可以分析誘變劑引起質粒DNA的直接損傷，即定標性突變(Targeted-Mutation)；也可分析誘變劑引起宿主細胞內環境改變從而造成質粒DNA分子的間接損傷，即非定標性突變(Non-targeted-Mutation)。本試驗只對[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引發質粒DNA的定標性突變進行了研究，如果結合其引發的非定標性突變，并比較兩者引起質粒DNA一級結構改變的差異，同時測定[b]喹[/b][b]乙醇[/b]引起質粒靶基因核苷酸序列改變是否有劑量-反應關系，則對[b]喹[/b][b]乙醇[/b]在哺乳動物細胞突變機制的研究就更為全面，這有待進一步研究。[/p][p=30, 2, left]　　總之，目前所用的穿梭質粒系統都是檢測質粒靶基因DNA的突變結果。而化學致突物干擾細胞DNA復制和修復或直接結合在DNA上造成的損傷還不能被檢測，如果能從這一層面研究誘變物的突變[b]機理[/b]，則研究結果將更具體和深入。[/p]