抗菌肽知識系列大講堂（十）

輕松由我 · 發表于 2010-5-4 15:58:23

抗菌肽的基因工程表達（二）

酵母表達系統：

1. 酵母表達系統的特點
雖然大腸桿菌是目前最為成熟的基因表達系統，但作為原核生物，它不具有真核生物的基因表達調控機制，也不具有對外源蛋白的加工修飾能力。近年來，人們已經將注意力轉移至跟大腸桿菌同樣具有繁殖快、易于培養、遺傳操作簡單、可工業化生產等特點的酵母表達系統，并且除了上述優點以外還具有使蛋白折疊、磷酸化、糖基化、酰胺化等修飾能力，避免了蛋白以包涵體形式表達、活性降低等問題。

酵母表達系統中最早使用的是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，曾經用其成功表達過干擾素、胰島素等外源基因，但在工業應用時其缺點也逐漸顯現出來，如培養基成本高、容易發生過度糖基化、質粒丟失、拷貝數下降等。為了克服釀酒酵母的局限，美國Daly等最先發展了以甲基營養型酵母(Methylotrophic yeast)為代表的第2代酵母表達系統。其中巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是發展最為迅速的，最初這種酵母菌是用于生產家畜飼料單細胞蛋白，它可以在以甲醇為唯一碳源的培養基中生長，其細胞中含有醇氧化酶(Alcoholoxydase，AOX)、二羥丙酮合成酶、過氧化氫酶等甲醇代謝途徑必須的酶。畢赤酵母表達系統具有多種有利于外源基因表達的優勢，與其他系統相比，更加便捷、高效，近幾年每年報道的在畢赤酵母中表達的外源基因就有幾十種。美國FDA評價該系統是安全的，并且已有來自于該表達系統的蛋白類制劑獲得批準。與其他表達系統相比，畢赤酵母表達系統具有以下特點：

(1)巴斯德酵母具有很強的醇氧化酶基因(AOX)啟動子，可以嚴格調控異源蛋白的表達。

(2)巴斯德畢赤酵母有完備的發酵方法，可高密度連續培養，在發酵罐中細胞干重可達100g/l以上，便于工業化生產。

(3)巴斯德畢赤酵母的表達產物表達量較高，并且既可以在胞內積聚又可以分泌到細胞外，而其自身的分泌蛋白非常少，有利于純化。

(4)異源蛋白借助質粒以單拷貝或多拷貝的形式整合到巴斯德畢赤酵母基因組中，有助于穩定遺傳。

(5)巴斯德畢赤酵母翻譯后加工過程中的糖基化程度更合理。

當然除了上述優點，目前甲醇酵母表達系統也還存在著一些問題，如某些蛋白的表達量相對較低甚至不能表達；分泌表達產物不均一，存在聚合體、信號肽加工不完全、表達產物降解等。所以在實驗中還需不斷地摸索。

2. 基因的構建及表達
目的基因的獲得可以從動物體中提取RNA，將其反轉錄擴增后得到cDNA，利用此方法已經得到豬抗菌肽PR-39基因；或根據抗菌肽氨基酸殘基種類和其殺菌活性的相關性，替換某幾個氨基酸或將2種抗菌肽基因結合構造雜合肽。如將cecropin Bl5和17等位點的氨基酸替換后，其抗菌活性明顯提高；cecropin A N端1～7位和Milittin N端5～12位氨基酸雜合后，其產物具有熱穩定性和高抑菌活性。目前在巴斯德畢赤酵母已表達的抗菌肽包括：人源抗菌肽LL-37，通過克隆cDNA，得到111 bp的重組基因，已在X一33中表達，所用質粒為pGAPZB；來源于中國家蠶的ABP—CM4，在GSll5中以pPICZaA為載體，得到了3．8 ku的表達產物；Jin等同樣以pPICZaA為載體，在SMDll68中表達了cecropinA和magain-in2的雜合肽。