雞傳染性喉氣管炎診斷技術

lzm_001

雞傳染性喉氣管炎診斷技術

NY/T 556—2002
前言
雞傳染性喉氣管炎是雞的重要疫病之一，世界動物衛生組織[World Organization for Animal Health(英)，Office Intentional des Epizootic(法)，OIE]將本病定為B類動物疾病，我國定為二類動物疫病。
本標準主要參照OIE推薦的雞傳染性喉氣管炎(ILT)診斷方法制定。
本標準的附錄A、附錄B為規范性附錄。
本標準由農業部畜牧獸醫局提出。
本標準由全國動物檢疫標準化技術委員會歸口。
本標準起草單位:農業部動物檢疫所。
本標準主要起草人:范根成、王永玲、劉相娥、王紅。
1范圍
本標準規定了雞傳染性喉氣管炎病毒分離及瓊脂凝膠免疫擴散試驗的技術要求。
本標準規定的病毒分離技術，適用于本病的確診。瓊脂凝膠免疫擴散試驗，適用于傳染性喉氣管炎的血清學診斷及用傳染性喉氣管炎疫苗免疫后的抗體檢測。
2病毒分離鑒定技術
2.1材料準備
2.1.1病料的準備
2.1.1.1活體采樣:用滅菌棉拭子伸入口咽或氣管采集分泌物，放入含青霉素4000 IU/mL，鏈霉素4000 μg//mL的無菌生理鹽水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，處理方法同上。
2.1.1.2尸體采樣:無菌采取病死雞喉頭和氣管，放入無菌的平皿或燒杯中，密封。
2.1.2樣品的運送。
采集的樣品應立即放入4℃冰箱保存，24h內送到實驗室；不能在24h內送到實驗室時，應將所采樣品冷凍保存和運輸。2.1.3樣品處理
2.1.3.1收到棉拭子樣品后，先經凍融兩次，并充分振動、擠干棉拭子，將樣品液經10000 r/min離心10min，取上清液，加入青霉素4000 IU/mL、鏈霉素4000 μg//mL，于37℃作用30min，作為接種材料。
2.1.3.2組織樣品:無菌條件下將組織剪碎，按1:4加入生理鹽水后用研磨器研磨制成20%的勻漿懸浮液，再經10000 r/min離心10 min ，取上清液，加入青霉素4000 IU/mL，鏈霉素4000μg//mL，于37℃作用30min ，作為接種材料。
2.2操作方法
2.2.1樣品接種
取經處理過的樣品，接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜。每枚0.2mL，接種后的雞胚在37℃孵育，每天觀察雞胚2次，連續觀察7d ，棄去24h內死亡的雞胚，24h～120h內死亡的雞胚，放4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成；120 h仍不死亡的雞胚，亦取出，置4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成。有痘斑者，取出雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，無菌研磨后，置－20℃凍存備用；無痘斑者，亦取出雞胚絨毛尿囊膜和尿囊液，無菌研磨，反復凍融，離心后，接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜盲傳。如此盲傳3代以上，如仍無病變，則判為雞傳染性喉氣管炎陰性。
2.2.2病毒鑒定
病毒分離物的鑒定:用雞傳染性喉氣管炎標準陽性血清(效價在1:32以上)和標準陰性血清與分離物作雞胚中和試驗，固定血清，稀釋病毒法中和試驗操作方法。
血清處理:將傳染性喉氣管炎標準陽性血清和標準陰性血清56℃滅活處理30min。
病毒稀釋:將病毒分離物用含青霉素1000 IU/mL、鏈霉素1000 μg/mL的滅菌生理鹽水稀釋，稀釋方法見表1。
表1病毒分離稀釋方法
管號 病毒分離物稀釋度 試管中的混合液
1 2×10-1 1mL病毒分離物愿液+4mL稀釋液
2 2×10-2 1mL2號管液+9mL稀釋液
3 2×10-3 1mL3號管液+9mL稀釋液
4 2×10-4 1mL4號管液+9mL稀釋液
5 2×10-5 1mL5號管液+9mL稀釋液
病毒-血清混合液:設兩排試驗管，每排4個管，第1排每管放0.6mL標準陽性血清，第2排每管放0.6mL陰性血清，然后向每排1～4號試驗管內分別加入(2×10-2～2×10-5)稀釋的病毒懸液各0.6mL，將病毒-血清懸液混合并置冰箱(4℃～8℃)4h。
雞胚接種及結果判定:取經處理過的病毒-血清混合液，分別接種9～12日齡的雞胚絨毛尿囊膜，0.2mL/枚，每管接種5枚，接種后的雞胚在37℃孵育，每天觀察雞胚2次，連續觀察7d，棄去24h內死亡的雞胚，24h～120h內死亡的雞胚，放4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成；120h仍不死亡的雞胚，亦取出，置4℃冷卻后，觀察雞胚絨毛尿囊膜上有無痘斑形成。記錄觀察結果，按半數致死量(Reed—Muench)方法計算EID50，計算方法見附錄A(規范性附錄)。
2.3結果判定
如分離物能引起雞胚絨毛尿囊膜出現典型的痘斑，并且經雞胚中和試驗，其陰性血清組和陽性血清組的EID50的對數之差大于或等于2.5時，則判定分離物為雞傳染性喉氣管炎病毒。
3瓊脂凝膠免疫擴散試驗
3.1材料準備
3.1.1器材:燒杯，直徑85mm培養皿，孔徑4mm的打孔器，6～9號針頭，微量移液器及針頭。
3.1.2瓊脂擴散抗原。
3.1.3標準陽性血清。
3.1.4被檢血清:無菌采血，分離血清，4℃或-20℃保存備用。
3.1.5瓊脂平板:配制方法見附錄B(規范性附錄)。
3.2操作方法
3.2.1瓊脂板打孔
在瓊脂糖平皿上，按坐標紙上畫好的梅花型(見圖1)打孔，孔徑4mm，孔間距3mm。挑出孔內瓊脂，在火焰上封底。
①　②
⑥　⑦?、?br> ⑤?、?br> 圖1　　打孔樣式
3.2.2加樣
用微量移液器加樣，中央孔(7孔)加抗原，1、3、5孔加標準陽性血清，2、4、6孔加待檢血清，每孔均以加滿不溢出為度。
3.2.3反應
加樣完畢后，靜置10min ，放入37℃帶蓋的濕盒中反應，分別在12h、24h、36h觀察并記錄結果。
3.3結果判定
3.3.1判定方法
將瓊脂板置暗背景或強光照射下觀察。標準陽性血清孔與抗原孔之間出現一條清晰的沉淀線，則試驗成立；若無沉淀線或沉淀線不明顯，則試驗不成立，應重做。
3.3.2判定標準
3.3.2.1被檢樣品孔與中央孔之間形成清晰的沉淀線，并與標準陽性血清孔的沉淀線相融合者，為陽性。
3.3.2.2被檢血清孔與抗原之間不形成完整的沉淀線，但標準陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端向被檢血清孔的內側彎曲看，為弱陽性。
3.3.2.3被檢血清孔與抗原之間無沉淀線，標準陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線直伸向被檢血清孔的邊沿無彎曲者，判為陰性。
3.3.2.4有的被檢血清與抗原之間可能出現兩條以上沉淀線，其中一條與標準陽性血清-抗原間沉淀線融合者判為陽性；均不融合者為陰性，此沉淀線為非特異性沉淀線。
附錄A
(規范性附錄)
雞胚半數感染量(EID50)測定方法(Reed-Muench法)
B.1定義
雞胚半數感染量(EID50)指能使50%雞胚感染的病毒量，常用Reed-Muench法計算。
B.2計算公式
按式(A.1)、式(A.2)計算:
lg EID50=高于50%死亡率的病毒稀釋度的對數+距離比例值×稀釋倍數的對數……………(A.1)
距離比例值=(高于50%死亡率-50%)/(高于50%死亡率-低于50%的死亡率) ……………(A.2)
B.3舉例
病毒毒價測定(接種數量0.1mL/枚)見表A.1。
表A.1
接種病毒稀釋 雞胚 累計數 死亡數/總數比例 死亡百分數/%
死亡數 健活數 死 活
10-4 5 0 12 0 12/12 100
10-5 4 1 7 1 7/8 88
10-6 2 3 3 4 3/7 43
10-7 1 4 1 8 1/9 11
表中第1列為接種的稀釋度，第2列為死亡雞胚數，第3列為活雞胚數，后面的兩列分別是第2列和第3列的累計數。
距離比值=(88%-50%)/(88%-43%)=38/45=0.84
lg EID50=-5+0.84×(-1)=-5.84
EID50=10-5.84/0.1mL
附錄B
(規范性附錄)
瓊脂平板制備方法
用含8%氯化鈉的蒸餾水加萬分之一疊氮化鈉配制成1%瓊脂糖，103kPa高壓蒸汽滅菌或水浴加熱使瓊脂充分溶化，加入直徑為85mm的培養皿中，每皿16mL，平置，室溫下凝固后，置4℃備用。

蒙城獸醫

我一直想做，只是沒條件做，以前在學校實驗室的時候沒有病料，現在有了病料卻沒有實驗室。

xxc1963

對臨床獸醫幫助不大啊