波爾山羊良種繁育技術(shù)試驗(yàn)研究

apple12151007 · 發(fā)表于 2010-9-3 13:07:28

　　余華1 葉健強(qiáng)2*

　　(1. 四川出入境檢驗(yàn)檢疫局，四川成都 610041;

　　2. 四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都, 610066)

　　波爾山羊是南非育成的一個(gè)世界公認(rèn)的著名優(yōu)秀肉用山羊良種，具有體軀高大，后軀發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)發(fā)育快，肉質(zhì)好，屠宰率高，繁殖無(wú)季節(jié)性，適應(yīng)性強(qiáng)，雜交改良當(dāng)?shù)厣窖蛐Ч@著等特點(diǎn)。我國(guó)于1995年開始少量引進(jìn)布爾山羊，并通過(guò)與當(dāng)?shù)匮螂s交取得了顯著的改良效果和經(jīng)濟(jì)效益。現(xiàn)在由于我國(guó)國(guó)內(nèi)的波爾山羊引種數(shù)量有限，純種羊數(shù)量少，因此需要大量的擴(kuò)繁純種的波爾山羊。在自然純繁的基礎(chǔ)上，為了加速純種繁育，我們開展了優(yōu)秀波爾山羊胚胎移植工作。胚胎移植可以最大限度地發(fā)揮純種優(yōu)秀母羊的繁殖潛力和優(yōu)秀遺傳基因的利用，大大加快良種羊的純種繁育速度，提高繁殖效率，誘發(fā)母羊產(chǎn)多胎，擴(kuò)大良種羊群等。本研究根據(jù)胚胎移植的關(guān)鍵技術(shù)(供體羊和受體羊的選擇、供體羊超數(shù)排卵處理和配種、人工授精、受體羊同期發(fā)情處理、胚胎回收與鑒定、胚胎保存和胚胎移植等)已經(jīng)形成一套成熟的波爾山羊良種繁育技術(shù)方案，應(yīng)用于波爾山羊的規(guī)模化生產(chǎn)。
　　1 材料和方法
　　1.1材料
　　1.1.1 試驗(yàn)種母羊、種公羊試驗(yàn)種母羊?yàn)閲?guó)外引進(jìn)的原種波爾山羊母羊或其所產(chǎn)后代，臨床健康, 斷奶一個(gè)月以上，生殖器官無(wú)可見(jiàn)異常。種公羊?yàn)閲?guó)外引進(jìn)的原種波爾山羊或其所產(chǎn)后代，年齡2～4歲，臨床健康，性欲旺盛，精液品質(zhì)優(yōu)良。
　　1.1.2試驗(yàn)用受體羊受體羊是從不同地區(qū)購(gòu)入的有正常繁殖史的經(jīng)產(chǎn)雅安奶山羊、成都麻羊、簡(jiǎn)陽(yáng)大耳羊和南江黃羊，或體格發(fā)育成熟的青年母羊，并適應(yīng)飼養(yǎng)一個(gè)月以上，臨床健康。
　　1.1.3 藥品及試劑促卵泡素[FSH，國(guó)營(yíng)寧波激素制品廠(寧一廠)，批號(hào)20000629、20010515;寧波第二激素廠(寧二廠),批號(hào)2000618、20010602;澳大利亞產(chǎn)，批號(hào)COIIV-L080;中科院動(dòng)物所，2002年生產(chǎn)]。促排卵素3號(hào)(LRH-A3, 寧波第二激素廠，批號(hào)20000220)。氯前列烯醇(PG，上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所，批號(hào)02717)。羊?qū)嵱眯腿仓Z酮陰道栓(西北農(nóng)林科技大學(xué)小動(dòng)物胚胎工程二室試制)。胚胎回收液體(沖卵液)：含2～5%滅活新生犢牛血清(NCS)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┳耘洹Ｅ咛ケ４嬉海汉?0% NCS的PBS。
　　1.1.44 主要器械及設(shè)備腹腔鏡，體視顯微鏡，恒溫水浴鍋，手術(shù)器械，自制手術(shù)保定臺(tái)，自制專用胚胎回收及移植器械。
　　1.2 方法
　　1.2.1 超數(shù)排卵處理將初選合格的波爾山羊母羊，用實(shí)用型炔諾酮陰道栓進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理7～10 d后開始采用FSH-PG法進(jìn)行超數(shù)排卵。方法1：生理鹽水稀釋FSH，按遞減法多次注射;方法2: 用30%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液稀釋后一次注射總劑量。兩種方法都分別在注射FSH后60 h和72 h注射PG，并在第一次注射PG時(shí)撤除陰道栓。母羊發(fā)情后每隔8～12 h配種一次，至發(fā)情結(jié)束。發(fā)情配種當(dāng)天計(jì)為0 d, 在第5 d用腹腔鏡檢查卵巢反應(yīng)，適宜手術(shù)回收胚胎者在第6 d用手術(shù)法回收子宮胚胎。
　　1.2.2 胚胎回收與質(zhì)量鑒定手術(shù)前將手術(shù)羊空腹24小時(shí),術(shù)前麻醉、保定,術(shù)部剃毛、消毒，進(jìn)行胚胎回收。回收液體靜置2～5 min后，將集卵杯置體視顯微鏡下(15～20×)撿卵,并用新鮮的操作液體凈化胚胎2～3次，在60×下對(duì)胚胎進(jìn)行形態(tài)質(zhì)量分級(jí)，A、B、C級(jí)定為可用胚，置胚胎保存液中待移植，或進(jìn)行胚胎分割或冷凍，剔除D級(jí)胚及未受精卵。
　　1.2.3 受體同期發(fā)情處理程序及同期發(fā)情有效性判定用國(guó)產(chǎn)炔諾酮陰道栓、FSH和PG組成三種誘導(dǎo)山羊同期發(fā)情的處理程序，對(duì)初選合格的母羊進(jìn)行同期發(fā)情處理。程序1：陰道放置羊?qū)嵱眯腿仓Z酮陰道栓(0d)，11d撤栓，同時(shí)肌注FSH 33單位;程序2：放置炔諾酮陰道栓(0d)，10d肌注FSH 25單位，12h后撤栓，同時(shí)二次肌注FSH 25單位，并注射PG 0.1mg;程序3：肌注PG 0.1mg(0d)，6d放置炔諾酮陰道栓，16d肌注FSH 25單位，12h后撤栓，同時(shí)二次肌注FSH 25單位，并注射PG 0.1mg。處理程序從撤除炔諾酮陰道栓結(jié)束，從撤栓后12h開始，每隔12h用試情公羊試情，觀察發(fā)情情況，母羊接近公羊、搖尾、接受公羊爬跨或母羊互相爬跨者判定為發(fā)情，96h內(nèi)發(fā)情者為同期發(fā)情處理有效。記錄發(fā)情羊號(hào)，并繼續(xù)試情、記錄每只羊的發(fā)情持續(xù)期，觀察到一次發(fā)情者持續(xù)期記為12 h、觀察到二次發(fā)情者持續(xù)期記為24 h，依此類推，直到連續(xù)發(fā)情結(jié)束。在發(fā)情結(jié)束后5 d用腹腔鏡觀察發(fā)情羊卵巢上排卵及黃體發(fā)育情況，記錄黃體側(cè)別及黃體數(shù)和質(zhì)量，并記錄未排卵卵泡大小及數(shù)量，卵巢上卵泡正常發(fā)育、排卵并形成正常功能黃體，同時(shí)卵巢上無(wú)卵泡或只有較小卵泡的受體羊作為可用受體，于5～6 d進(jìn)行手術(shù)胚胎移植;或在手術(shù)時(shí)探察并記錄卵巢上排卵及黃體發(fā)育情況，排卵并發(fā)育為功能黃體的受體進(jìn)行胚胎移植。
　　1.2.4 胚胎移植采用手術(shù)方法將保存的可用胚移植于同期發(fā)情的受體羊黃體側(cè)子宮角前1/3。移植器械為自制專用胚胎移植器械，移植手術(shù)時(shí)，做到操作輕巧、動(dòng)作穩(wěn)妥可靠、避免過(guò)度牽拉生殖器官、禁止擠壓卵巢，以盡量減輕手術(shù)損傷。胚胎移植效率以移植受體妊娠率和移植胚胎最終發(fā)育為出生羔羊的胚胎成羔率計(jì)算，其中妊娠受體只計(jì)算妊娠到期產(chǎn)羔和觀察到的流產(chǎn)受體。統(tǒng)計(jì)分析受體妊娠率和胚胎成羔率。
　　2 結(jié)果
　　2.1 超數(shù)排卵結(jié)果
　　共超排處理120只波爾山羊，回收胚胎1849枚,平均每只15.4±7.20枚，其中可用胚16.8枚，平均13.4±7.94枚，各年度超排結(jié)果見(jiàn)表1。
　　表1 波爾山羊超數(shù)排卵結(jié)果

年度	羊數(shù)(只)	回收卵數(shù)(枚)		可用胚數(shù)(枚		可用胚比率(%)
年度	羊數(shù)(只)	總數(shù)	平均數(shù)(±Sd)	總數(shù)	平均數(shù)(±Sd)	可用胚比率(%)
2003	40	608	15.2±10.06a	538	13.5±8.01a	88.5 a
2004	50	752	15.0±9.25a	658	13.2±8.26 a	87.5 a
2005	30	481	16.0±7.05 a	412	13.7±7.82 a	85.8 a
合計(jì)	120	1849	15.4±7.20	1608	13.4±7.94	87.0

　　同列上標(biāo)字母不同者差異顯著 P<0.05
　　2.2同期發(fā)情結(jié)果
　　共處理了1218只受體山羊，各年度同期發(fā)情只數(shù)、發(fā)情羊正常排卵并形成功能黃體的只數(shù)及處理羊總有效率情況見(jiàn)表2。
　　表2 受體山羊同期發(fā)情結(jié)果

年度	處理只數(shù)(只)	發(fā)情只數(shù)(只)	排卵并形成功能黃體只數(shù)(只)	處理羊總有效率(%)
2003	400	385	366	91.5
2004	500	492	453	90.6
2005	318	306	282	86.8
合計(jì)	1218	1183	1101	90.4

　　2.3胚胎移植結(jié)果
　　將1608枚新鮮胚胎移植給961只受體，受體妊娠率達(dá)64.3%，胚胎成羔率達(dá)54.%。各年度胚胎移植結(jié)果見(jiàn)表3
　　表3 新鮮胚胎移植結(jié)果

年度	移植受體數(shù)	移植胚胎數(shù)	妊娠受體數(shù) (受體妊娠率%)	產(chǎn)羔數(shù) (胚胎成羔率%)
2003	320	538	214(66.9)	270(50.2)
2004	412	658	253(61.4)	380(57.8)
2005	229	412	151(66.0)	218(53.0)
合計(jì)	961	1608	618(64.3)	868(54.0)

　　3 分析
　　3.1 超排效果穩(wěn)定性分析
　　從表1統(tǒng)計(jì)的結(jié)果看，在三個(gè)年度進(jìn)行超排時(shí)，都能夠取得較滿意的超排效果，平均回收卵數(shù)15.4±7.20枚，平均獲得桑葚胚及囊胚期可用胚13.4±7.94枚，優(yōu)于或類似于同期報(bào)道的波爾山羊超排結(jié)果，但其中有的報(bào)道采用的是胚胎回收率相對(duì)較高的輸卵管回收法，這種回收方法對(duì)生殖器官的損傷相對(duì)較大，易造成生殖器官粘連，而且移植產(chǎn)羔率也相對(duì)較低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各年度超排羊回收卵平均數(shù)和可用胚平均數(shù)之間及各年度回收卵可用胚比率間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。說(shuō)明我們的超排程序已經(jīng)達(dá)到了非常穩(wěn)定的效果。
　　影響超數(shù)排卵有效性的因素很多，有個(gè)體差異，超排激素的來(lái)源、劑量、注射程序，供體羊的營(yíng)養(yǎng)、繁殖生理狀況等多種因素。根據(jù)我們的試驗(yàn)研究經(jīng)驗(yàn)，歸納以下幾點(diǎn)：①用PVP液稀釋FSH后單次注射的超排結(jié)果較好，但這種注射方法的一個(gè)主要缺陷是，處理程序結(jié)束后超排羊開始發(fā)情的時(shí)間差異太大，而且發(fā)情持續(xù)期差異也比較大，在生產(chǎn)條件下進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用時(shí)，難以安排合適的發(fā)情同期化的受體羊進(jìn)行胚胎移植，不適于產(chǎn)業(yè)化胚胎移植的精確化和標(biāo)準(zhǔn)化的要求。②采取適宜的超排程序，只要激素質(zhì)量有所保證，國(guó)內(nèi)與國(guó)外生產(chǎn)的激素用于波爾山羊超排均是可行的，而且超排激素的國(guó)產(chǎn)化對(duì)良種山羊胚胎移植產(chǎn)業(yè)化具有重大意義，可以降低應(yīng)用成本，增加經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)國(guó)產(chǎn)胚胎移植產(chǎn)品的系列化配套。③我們?cè)囼?yàn)性地在春季進(jìn)行了少量的超數(shù)排卵處理，取得了滿意的超排效果，與秋季超排結(jié)果無(wú)顯著差異。④體質(zhì)較差的母羊，其營(yíng)養(yǎng)水平不能滿足卵泡的正常發(fā)育和排卵，從而會(huì)影響超排的有效性。⑤在胚胎移植產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用時(shí)，必須選擇生長(zhǎng)發(fā)育完全成熟的經(jīng)產(chǎn)母羊進(jìn)行超排，而且以2～3胎母羊超排效率較高。⑥首次超排效果較好的供體母羊可以進(jìn)行重復(fù)超排，只要不嚴(yán)重?fù)p傷生殖器官，進(jìn)行重復(fù)超排時(shí)仍能取得較滿意的超排效果。這將會(huì)大大提高胚胎移植供體羊的有效利用率。
　　3.2 同期發(fā)情效果分析
　　在發(fā)情周期的不同階段，母畜生殖器官的內(nèi)分泌環(huán)境、生化和組織學(xué)特性，對(duì)不同發(fā)育階段的胚胎有不同的影響。所以在胚胎移植工作中，應(yīng)做到使受體與供體的發(fā)情同期化，并將胚胎移植到與供體處于相應(yīng)發(fā)情階段的受體生殖道(子宮或輸卵管)的適當(dāng)部位，使胚胎在受體所處環(huán)境的生理狀態(tài)與供體相同，才能繼續(xù)發(fā)育。所以在山羊胚胎移植規(guī)模化生產(chǎn)應(yīng)用中，提高受體羊同期發(fā)情效率、從而提高受體羊利用率，是胚胎移植成功與否、效益大小的關(guān)鍵技術(shù)之一。
　　我們?cè)谘芯恐校耆x用國(guó)產(chǎn)炔諾酮陰道栓、促卵泡素(FSH)和氯前列烯醇(PG)等同期發(fā)情制劑，首先用程序1誘導(dǎo)山羊同期發(fā)情，并加以改進(jìn)逐漸過(guò)渡到使用程序2及程序3，形成了較為有效和標(biāo)準(zhǔn)化的處理程序。同時(shí)，用該程序處理羊同期發(fā)情后正常排卵并形成功能黃體的比率也非常高，這一指標(biāo)能準(zhǔn)確反映處理羊最終能夠作為胚胎移植可用受體的比例(即同期發(fā)情總有效率)，能為合理安排供、受體羊比例提供了準(zhǔn)確的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。與國(guó)外、或國(guó)內(nèi)使用進(jìn)口同期發(fā)情處理制劑的同類研究相比，同期發(fā)情效率及穩(wěn)定性較高。而且通過(guò)對(duì)不同同期發(fā)情制劑及輔助處理方法的改進(jìn)，使同期發(fā)情總有效率逐漸提高。
　　在同期發(fā)情處理中主要采用孕激素及其類似物、前列腺素，促性腺激素一般只作為輔助處理制劑，可以提高同期發(fā)情效率。前列腺素處理法是溶解母羊卵巢上的黃體而誘導(dǎo)同期發(fā)情的方法，使用簡(jiǎn)單方便，但其缺點(diǎn)是只對(duì)卵巢上有黃體的母羊起作用，對(duì)發(fā)情周期不正常、不處于發(fā)情周期黃體期或某些季節(jié)卵巢相對(duì)靜止的羊只無(wú)效，相對(duì)而言其同期發(fā)情效率不如孕激素處理法高，所以在胚胎移植中要達(dá)到一定數(shù)量的可用受體，必須增加被處理母羊的基數(shù)，這樣勢(shì)必增加胚胎移植中受體羊數(shù)量和飼養(yǎng)管理的成本。孕激素及其類似物處理法的可以克服前列腺素處理法的不足，常常與促性腺激素配合使用而同期發(fā)情效率較高，所以我們?cè)谘芯砍跗诩催x用這種方法進(jìn)行受體羊同期發(fā)情處理(程序1)，而且選用近年應(yīng)用較多的短周期處理(11 d)，在研究應(yīng)用過(guò)程中還配合去栓時(shí)加注小劑量PG的處理方法(程序2)，以增加同期性。為了進(jìn)一步增加同期發(fā)情總有效率，降低受體羊群的數(shù)量，我們根據(jù)山羊發(fā)情周期中生殖內(nèi)分泌基本規(guī)律，又對(duì)處理程序做了進(jìn)一步改進(jìn)，在放置炔諾酮陰道栓前加用一次小劑量PG，調(diào)整整個(gè)羊群的發(fā)情周期，之后再用炔諾酮陰道栓預(yù)處理，經(jīng)過(guò)一個(gè)孕激素作用周期，使受處理的所有羊只的生殖生理狀態(tài)進(jìn)一步統(tǒng)一，從而取得了非常滿意的同期發(fā)情有效性。
　　三種程序處理的受體山羊，大部分集中在去栓后24～60 h發(fā)情，發(fā)情持續(xù)期集中在24～60 h，各程序之間也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，三個(gè)處理程序誘導(dǎo)同期發(fā)情的羊只發(fā)情特點(diǎn)的類似，說(shuō)明方法的不同會(huì)產(chǎn)生不同的同期發(fā)情處理結(jié)果，而不會(huì)改變母羊的發(fā)情生理表現(xiàn)，而恰恰這一點(diǎn)也是我們?cè)谂咛ヒ浦补ぷ髦兴P(guān)心的關(guān)鍵問(wèn)題之一，進(jìn)一步說(shuō)明我們所采用的同期發(fā)情處理程序，不僅有效，而且不會(huì)改變發(fā)情羊生殖生理規(guī)律，而對(duì)提高胚胎移植效率有較大的實(shí)際意義。
　　在山羊胚移中，一般要求供、受體羊同期化程度為供體與受體同步差在±24 h內(nèi)，而且最好是-12 h，即受體羊晚于供體羊。而供、受體羊發(fā)情同期化的實(shí)質(zhì)應(yīng)該是排卵時(shí)間的同期化，山羊的排卵時(shí)間一般都在發(fā)情結(jié)束之前的一段時(shí)間，這就需要以發(fā)情結(jié)束時(shí)間來(lái)判斷同期化。在波爾山羊胚胎移植中，安排受體同期發(fā)情程序的結(jié)束點(diǎn)時(shí)，受體羊的撤栓時(shí)間應(yīng)安排在比供體提前12 h～20 h左右為宜。
　　3.3 胚胎移植效率分析
　　胚胎移植數(shù)量、受體羊品種、黃體數(shù)量及質(zhì)量對(duì)胚胎移植效率的均有影響。移植胚胎數(shù)量不同的受體，妊娠率和妊娠到期產(chǎn)羔的受體比率差異不顯著(P<0.05)，而移植胚胎最終發(fā)育為出生羔羊的比率差異顯著(P<0.05)，移植單胚、雙胚、三胚和四胚時(shí)胚胎成羔率分別為60.2%(171/284)、51.5%(890/1724)、41.33%(31/75)和36.36%(16/44)。各品種受體胚胎移植后妊娠率雖有所不同，移植雙胚時(shí)胚胎成羔率存在顯著差異(P<0.05)，最終使不同品種受體羊之間胚胎移植效率出現(xiàn)差異。奶山羊受體移植雙胚時(shí)胚胎成羔率最高，與成都麻羊和簡(jiǎn)陽(yáng)大耳羊差異顯著(P<0.05)，南江黃羊低于奶山羊、高于成都麻羊和簡(jiǎn)陽(yáng)大耳羊，而且奶山羊和南江黃羊移植單胚和雙胚時(shí)胚胎成羔率差別不大，成都麻羊和簡(jiǎn)陽(yáng)大耳羊則差異比較大。各品種受體羊卵巢上只有一個(gè)黃體與兩個(gè)黃體時(shí)，胚胎移植妊娠率無(wú)顯著差異，而且都非常接近。黃體大小不同時(shí)，受體妊娠率及胚胎成羔率差異不顯著，而隨著黃體大小變化有逐漸下降。這提示我們，在胚胎移植實(shí)際應(yīng)用中，只要同期發(fā)情受體羊正常排卵并發(fā)育為黃體，都可以作為可用受體進(jìn)行胚胎移植，但應(yīng)慎重選用卵巢上黃體發(fā)育太小的受體。