奶牛場常見病原微生物的鑒別

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　　奶牛場常見病原微生物的鑒別
　　及形成原因分析
　　郭榮(內蒙古興和縣畜牧局) 連文生(內蒙古涼城縣岱海鎮)
　　摘 要
　　本試驗對天津里自沽和紅光兩個奶牛場奶牛的乳汁、膿汁、滲出液、病變組織進行采集，通過細菌學和生化試驗，對病原微生物進行了分析和鑒定。分析鑒定結果顯示：其病原微生物分別是金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌，這些病原微生物引起奶牛乳房炎、子宮內膜炎等多種疾病。同時對病原微生物進行了藥敏試驗，藥敏試驗結果表明：這些病原微生物對臨床上常用的慶大霉素，克林霉素已形成了不同程度的耐藥性，而對強力霉素，氧氟沙星則表現較高的敏感性。試驗結果可為奶牛場選擇用藥提供科學依據。
　　關鍵詞: 病原微生物;分離;鑒定;生化試驗;藥敏試驗
　　ABSTRACT
　　In order to indentify and analysis pathogenic microbilogical, milk, pusjuice, extravasate and the pathological tissues were gathered from lizigu cattle farm and hongguand cattle farm in tianjin in the experiment.The result is that pathogenic microbiologies were separated, they are staphylococcus aureus, streptococcus, E.coli. Certain pathogenic microbiologies cause cow mastitis, endometritis and other kinds of diseases. A drug and susceptibility test were carried. The result of drug and susceptibility test indicates that these pathogenic microbiologies have formed the varying degree drug resistance to the Qingda mildew and the Kelin mildew which the clinical commonly used, but the Qiangli mildew and oxygen fluorine Sha Xingze display better suppression effect. The result can provide scientific basis to choose the pointed medicine to treat cows’ disease for cattles.
　　Key word：Pathogenic microbiology;Isolation;Verification;Biochemistry test;Drug and susceptibility tes
　　1 前言
　　人類生存環境中的微生物種類非常之多，絕大多數微生物對人類、動物和植物是有益的，而且有些是必需的，能引起人類、動物和植物病害的微生物只是少數，這些具有致病性的微生物稱為病原微生物 [1]。當病原微生物存在于牛場中，常能引起奶牛發病，并且病原微生物感染也是引起奶牛發病的主要原因，牛場常見的乳房炎、子宮內膜炎、肢蹄病，其主要都是由病原微生物感染引起的 [2]。尤其乳房炎,是奶牛養殖過程中的一種最常見的多發性的疾病，乳房炎的病原體有80-130多種，其中主要的病原為鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，約占奶牛乳房炎病原菌的90% [3]。奶牛子宮內膜炎，也主要是由鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌等引起的 [4]。而奶牛的肢蹄病，是由壞死桿菌，病毒等引起，同時由乳房炎，子宮內膜炎產生的炎性產物，也可引發產生肢蹄病。
　　病原微生物引起的奶牛的三大疾病對奶牛業造成了重大的經濟損失。在奶牛飼養中，乳房炎是發病率最高、流行最快、造成損失最大的一種疾病。乳房炎對奶牛業造成的危害包括：1、直接造成產奶量的減少;2、由于牛奶變質和藥物殘留，人們不能食用而被迫倒掉牛奶;3、一些奶牛無法治愈而被淘汰所造成的損失;4、在治療乳房炎期間，所有醫療費的開支;5、護理病牛所需額外的勞動力開支等。 根據美國人的統計分析，一頭罹患乳房炎的牛其經濟損失可以高達45美元(折合人幣369元)[5]。子宮內膜炎是較為常見的一種產科疾病，嚴重影響奶牛的泌乳和繁殖，危害極大，可造成奶牛減產30%～50%,甚至被淘汰處理。子宮內膜炎不及時治療會引起持久黃體，從而導致發情周期停止而引起不育癥。該病不僅影響牛只健康成長，而且對母牛的繁殖、產奶量以及奶牛業的發展影響也較大[6]。在奶牛業中，肢蹄病是僅次于乳房炎和繁殖系統疾病而引起奶牛被迫淘汰的第三大最普遍的原因。肢蹄病會導致產奶量的下降和繁殖效率的低下。奶牛跛行90%是由于蹄的問題，且極大部分是由于后蹄的病原微生物感染發病而引起的，嚴重者甚至癱瘓[7]。因此，我們要加大對這些病的預防力度。
　　在病原微生物檢測方面，隨著科學技術的不斷發展，特別是分子免疫學，生物化學，分子生物學及計算機技術的不斷發展，以及專業技術人員的相互合作，新的微生物診斷技術和方法已廣泛被應用[8]。在分子生物學檢驗技術方面，尤其以是DNA探針，以PCR為代表的分子生物學技術及基因芯片技術的應用，已加快了微生物檢驗的速度，明顯提高了微生物的診斷水平。(1)DNA探針是建立在探針與被測標本基因序列同源的基礎上，進行檢驗的分子遺傳學技術。是用已知的一段DNA去識別被檢測的相應基因序列，以鑒定定位和定量病原體的遺傳信息，從而使基因探針成為檢測病原體一種特異試劑，可以達到快速、特異，同時可以得到減少細菌增殖危險性的微生物標本[9]。(2)PCR技術自1985年建立以來，發展之迅速、應用之廣泛，表明其具有強大的生命力。近些年來，基于 PCR 的基本原理，許多學者充分發揮創造性思維，對 PCR技術進行研究和改進，使 PCR 技術得到了進一步的完善，并在此基礎上派生出了許多新的用途[10]。PCR 可用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定，它是在同一 PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行 PCR 擴增，可用于同時檢測多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染[11]。(3)基因芯片技術是近年來分子生物學及醫學診斷技術的重要進展，該技術是通過把巨大數量的寡核苷酸，肽核苷酸或 cDNA固定在一塊面積很小的硅片、玻片或尼龍膜上而構成基因芯片。它主要是基于近年來的一種全新的 , DNA 測序方法之一雜交測序法應運而生的。由于該技術同時將大量的探針固定于支持物上，所以可以一次性對大量序列進行檢測和基因分析，解決了傳統的核酸印跡雜交操作復雜，操作序列數量少等缺點。基因芯片技術的突出特點在于其高度的并行性、多樣化、微型化和自動化。與傳統方法相比，生物芯片在疾病檢測診斷方面具有獨特的優勢，它可以在一張芯片同時對多個患者進行多種疾病的檢測。僅用極小量的樣品，在短時間內，即可提供大量的疾病診斷信息。這些信息有助于醫生在短時間內采取正確的治療措施。在國外現有某些疾病診斷用芯片，國內也有人在研究致病菌分析用芯片。在臨床基因診斷中，基因芯片也逐漸得以應用，如病原微生物的基因診斷，結核分枝桿菌等[12]。但DNA探針、以PCR為代表的分子生物學技術及基因芯片技術也存在著某些缺陷，如混合感染，耐藥菌株等，用傳統的基因診斷法有時也難以解決 [13]。
　　在分子生物學檢驗技術方面，DNA探針、以PCR為代表的分子生物學技術和基因芯片技術對病原微生物的檢測和分型具有廣泛的前景，但由于其成本高，操作處理復雜，需要現代化的試驗平臺和昂貴的試驗設備，使該技術目前僅主要用于研究領域，而用于病原微生物臨床檢測還處于幼年時期[14]。奶牛場主要以生產性為主，而并非側重科學研究，因此，目前奶牛場病原微生物的檢測還仍以傳統的微生物檢測方法為主，進行病料的涂片、染色、鏡檢、分離培養，以及藥敏試驗等[15-16]。
　　生物(尤指病原微生物)對抗生素等藥物易產生耐受和抵抗能力，即耐藥性或抗藥性，抗藥性的產生使正常劑量的藥物不再發揮應有的殺菌效果，甚至使藥物完全無效，從而給疾病的治療造成困難，并容易使疾病蔓延，因此臨床上進行藥物敏感試驗，停止那些無效且易造成殘留的藥物的使用，為奶牛場中疾病的控制提供科學依據，科學合理的使用治療藥物，減少奶牛疾病造成的經濟損失，保證乳制品安全和人類的健康。但許多研究證明，目前由于各奶牛場大劑量使用抗生素，導致微生物耐藥性的產生，許多常見的抗生素對細菌的治療已無效。
　　本試驗采用傳統的微生物檢測方法，對天津里自沽和紅光兩個奶牛場采集的病料，進行了病原微生物的分離鑒定，并在此基礎上進行了藥敏試驗，篩選出針對天津這兩個奶牛場中存在的主要病原微生物有效的藥物，為進行針對性的治療提供科學依據，從而更好地防止病原微生物的傳播和奶牛疾病的發生。
　　2 試驗材料與方法
　　2.1 試驗材料
　　病料：來自天津里自沽第二奶牛場150頭和紅光奶牛場100頭發病牛的乳汁、膿汁、滲出液和病變組織。
　　試驗器材：生物顯微鏡(麥克奧迪)、革蘭氏染色液、載玻片、蓋玻片、普通瓊脂培養基、血液瓊脂培養基、麥康凱培養基、接種環、酒精燈、藥物敏感紙片、鑷子、平皿。葡萄糖、氧化酶等生化反應試劑和指示劑(北京三藥科技開發公司生產,中國藥品生物制品檢定所監制)，生化鑒定所用微量發酵管是由杭州天和微生物試劑有限公司生產。
　　2.2 試驗方法
　　2.2.1 細菌學試驗
　　將采集的乳汁、膿汁、滲出液、病變組織，分別劃線接種于普通瓊脂培養基，血液瓊脂培養基，麥康凱培養基，置于37℃溫箱中培養24h后觀察菌落形態特征，選出典型菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。根據菌落形態、染色特性以及鏡檢結果，做出初步鑒定。
　　2.2.2 生化試驗
　　從培養基中挑取可疑菌落，采用傳統的方法將可疑菌分別接種于含有各種生化反應試劑的培養基中，分別進行葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、水楊苷七葉苷的發酵試驗，接觸酶、氧化酶、凝固酶試驗，吲哚試驗，甲基紅試驗，V-P試驗和枸櫞酸鈉利用試驗，根據各生化反應結果做出確切鑒定。
　　2.2.3 藥敏試驗
　　選用典型的分離菌株，以劃線的方式分別接種于普通瓊脂培養基表面，盡可能涂布得致密而均勻。用無菌鑷子將不同藥敏紙片分別均勻密貼于培養基表面，置于37℃溫箱中培養24h后，取出觀察結果。所選的抗菌藥物有：青霉素、氯霉素、鏈霉素、慶大霉素、氧氟沙星、復方新諾明、強力霉素、環丙沙星、痢特靈、克林霉素10種藥物。抑菌效果的判定：青霉素抑菌圈直徑大于26㎜為高度敏感，小于10㎜為低度敏感，介于10-26㎜之間的為中度敏感，無抑菌圈的為不敏感。氯霉素抑菌圈直徑大于25㎜為高度敏感，小于10㎜為低度敏感，介于10-25㎜之間的為中度敏感，無抑菌圈的為不敏感。鏈霉素、慶大霉素、氧氟沙星等參照抑菌效果標準以判定各種菌對藥物的敏感性。
　　3 結果與分析
　　3.1 試驗結果
　　3.1.1 細菌學試驗結果
　　細菌學試驗檢測出金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌，三種菌的生物學特性見表1。
　　表1 病原菌特性

項目	金黃色葡萄球菌	鏈球菌	大腸桿菌
染色	G+	G+	G-
鏡檢	圓形，葡萄串狀	圓形或卵圓形，鏈狀或成雙	直桿，兩端鈍圓，散在或成對
普通瓊脂培養基	濕潤、光滑、隆起的圓形菌落，直徑1-2㎜，金黃色	生長不良，形成針尖大小的菌落	生長良好，光滑，濕潤菌落
血液瓊脂培養基	菌落較大，菌落周圍形成明顯的溶血圈	直徑0.1-1㎜，灰白色，光滑，邊緣整齊的小菌落，形成溶血圈	圓形凸起光滑, 濕潤的白色菌落，2-3㎜
麥康凱培養基	不生長	不生長	生長旺盛，形成紅色菌落，不透明

　　3.1.2 生化試驗結果
　　生化試驗檢測金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌的反應結果見表2。
　　表2 病原菌生化反應特性

項目	金黃色葡萄球菌	鏈球菌	大腸桿菌
葡萄糖	+	+	+
麥芽糖	+	-	+
乳糖	+	+	+
接觸酶	+	-	V
氧化酶	-	/	-
甘露醇	+	-	+
水楊苷	/	V	V
凝固酶	+	/	/
七葉苷	-	-	V
吲哚	/	/	+
甲基紅	/	/	+
VP	V	/	-
枸櫞酸鈉利用	/	/	-

　　注：“+”陽性反應， “-”陰性反應， “V”種間出現不同反應， “/”是無反應
　　3.1.3 藥敏試驗結果
　　金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌的藥敏試驗結果見表3。
　　表3 主要病原菌藥敏試驗結果

項目	金黃色葡萄球菌	鏈球菌	大腸桿菌
青霉素	中度敏感	高度敏感	中度敏感
氯霉素	高度敏感	中度敏感	中度敏感
鏈霉素	中度敏感	高度敏感	中度敏感
慶大霉素	不敏感	低度敏感	不敏感
氧氟沙星	高度敏感	高度敏感	高度敏感
復方新諾明	低度敏感	不敏感	中度敏感
強力霉素	高度敏感	高度敏感	中度敏感
環丙沙星	中度敏感	中度敏感	不敏感
痢特靈	不敏感	不敏感	高度敏感
克林霉素	不敏感	不敏感	不敏感

　　3.2 分析
　　3.2.1 飼養管理因素
　　衛生狀況差的環境是病原微生物生長繁殖的重要場所。金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌廣泛分布于飲水、地面、土壤、空氣、飼料中，不良的環境為三種菌的生長繁殖創造了有利的條件。(1)牛舍低洼、陰暗潮濕，牛床地面不清潔，糞便堆積，不及時處理，牛只擁擠，引起病原菌大量繁殖。特別是夏季牛體不清潔，牛舍通風不暢，引起蚊蠅大量的孳生，為病原菌進一步傳播創造了有利的條件[17]。(2)不嚴格執行消毒防疫制度，擠奶時不注意衛生，擠奶工具沒有進行嚴格消毒，擠奶方式不對，過于用力，擠奶工具配套不全，內壁彈力不規則，乳頭護理不當等，使乳頭組織損傷，造成三種菌的感染[18]。(3)牛體表創傷未及時處理，為三種菌的繁殖創造了有利條件。
　　3.2.2 遺傳性因素
　　奶牛的體型和品種也與病原微生物的感染發病有關，品種不同，對某些病原微生物的易感性也不同。例如：具有懸垂乳房的奶牛比乳房小而結實的奶牛更易感染病原菌，因為此種乳房的乳頭更接近于地面而感染金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌 [19]。
　　3.2.3 疾病性因素
　　一些疾病如：奶牛胎衣不下、子宮內膜炎產生的病變組織和陰道分泌物感染乳頭，引起奶牛乳房炎，也易發生繼發性肢蹄病。犢牛和青年母牛發生外傷、關節周圍蜂窩組織炎、刺傷或內源性病源從消化道、呼吸道侵入局部時可發展為膿毒性關節炎。因此多種疾病相互繼發感染引起三種菌的廣泛傳播。
　　4 討論
　　4.1 對細菌學試驗結果的討論
　　由于不同區域，不同時間，不同奶牛場等原因，病畜所感染的病原微生物的種類也不盡相同。因此，一種鑒定結果不能成為通用的，應根據地區實際情況進行針對性的檢測、預防和治療[20]。從本試驗結果可以看出，對天津兩奶牛場病牛進行細菌學分析，致病微生物中金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌分離率最高，為主要的病原微生物，其它的菌分離率較低。其中，大部分病料樣本中都是兩種或兩種以上的病菌共同存在的現象，選擇用藥時應交叉用藥，不宜選擇只對一種菌有效的藥物。
　　4.2 對藥敏試驗結果的討論
　　從藥敏試驗結果可以看出，強力霉素，氧氟沙星顯示較好的抑菌作用，而治療疾病中使用較多的慶大霉素，克林霉素對常見致病菌幾乎無效，細菌對青霉素和鏈霉素也有了輕微的耐藥性。根據詢問調查結果了解到，兩個奶牛場長期大量使用慶大霉素、克林霉素、青霉素和鏈霉素，致使病原菌產生耐藥性。隨著抗菌藥物的廣泛應用，耐藥菌株的增多，細菌對常用抗生素的耐藥性愈來愈強，給奶牛疾病治療的選擇用藥帶來了很大困難，這意味著當這些動物和人類發病時很多抗菌藥物將無效[21]。目前,開發一種新的抗生素需要10年左右的時間，而一代耐藥菌的產生只要2年時間,即抗生素的研制速度遠遠趕不上耐藥菌的繁殖速度,如此下去,相當多的由耐藥菌引起的疾病將無藥可治[22]，由此，要及時進行藥敏試驗檢測，防止耐藥菌株的大量產生。
　　4.3 對疫苗預防接種的討論
　　病原微生物檢測結果表明，兩奶牛場中不存在結核桿菌、炭疽桿菌，布氏桿菌以及口蹄疫病毒，主要是因為兩奶牛場定期進行疫苗預防接種，預防了這些常見的結核病，炭疽病等的發生。做好正確的疫苗注射工作，使奶牛機體產生特異性抗體并保持在較高水平，可有效保護奶牛免受相應病原體的侵染[23]。預防接種及時防止了常見病的發生，減少了奶牛場的經濟損失。
　　5 結論
　　5.1 細菌學試驗的結論
　　在對天津里自沽和紅光兩個奶牛場病料分離出的病原細菌中，鏈球菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌均為主要病菌。三種菌引起了奶牛的乳房炎、子宮內膜炎等常見病，因此在治療方面應該選擇針對鏈球菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌強效的藥物進行治療。
　　5.2 藥敏試驗的結論
　　藥敏試驗表明奶牛致病菌對慶大霉素、克林霉素兩種常用抗菌藥物均已產生了很強的耐藥性，尤其是克林霉素，對三種細菌已無任何抑制作用。致病菌對青霉素、鏈霉素強效藥物也表現了輕度的耐藥性，而強力霉素，氧氟沙星抑菌效果較好，是較為敏感的治療藥物。因此奶牛場在治療時應盡量交叉用藥,不宜長期使用一種藥物，以防產生耐藥性;另外，傳染性致病菌和環境性致病菌對同一類藥物的敏感性也存在一定的差異，因此,應對牛場奶牛疾病采取以防為主、防治結合的綜合防治措施。根據本場實際情況，建立一整套的預防程序;對牛群要進行定期檢查，詳細記錄檢查結果，根據牛群的實際情況進行及時的防治。
　　5.3 疫苗預防接種的結論
　　里自沽和紅光兩個奶牛場定期進行了嚴格的疫苗預防接種，結核病、炭疽病，布氏桿菌以及口蹄疫等常見疾病在兩奶牛場中較少見。定期預防接種疫苗的效果比較好，防止了這些疾病的發生。奶牛場以生產性為主，防患于未然，對一些常見傳染性疾病宜采用預防措施，要抓好奶牛的疫苗注射工作。
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