纖維素酶

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　　纖維素是地球上最廉價、最豐富的可再生資源。全世界每年的植物體生成量高達1500億噸干物質，其中纖維素及半纖維素的總量為850億噸。但由于纖維素具有水不溶性的高結晶構造，其外圍又被木質素包圍著，要把它水解成可利用的葡萄糖相當困難，所以到目前為止仍未能得到很好地利用。隨著世界人口的驟增，資源面臨短缺的危機。如何有效的利用纖維資源對解決環境污染、食品短缺及能源危機等具有重大現實意義。利用微生物產生的纖維素酶(cellulase)來分解和轉化纖維素則是纖維素利用的有效途徑，故對纖維素酶的研究越來越引起人們的重視。纖維素酶于1904年在蝸牛消化液中最先被人們所發現，1945年在微生物中發現了此酶，此后，纖維素酶的研究和應用便逐步受到世界各國的關注。纖維素酶作為飼料添加劑始于20世紀70年代，我國也從這一時期開始進行初步的纖維素酶研究工作，近二十年來，進行了開發性研究工作，并應用到飼料工業中，取得了一定的效果。下面主要就纖維素酶的結構、功能特性、應用研究現狀及前景作一綜述。
　　1 纖維素酶的組成與分類
　　纖維素酶是指能降解纖維素的一類酶的總稱，是一個由多種水解酶組成的復雜酶系，主要來自于真菌和細菌。根據各酶功能的不同主要分為三類：1、葡聚糖內切酶(1，4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，E.C3.2.1.4，來自于真菌簡稱為EG;來自于細菌簡稱為Len)，這類酶一般作用于纖維素內部的非結晶區，隨機水解β-1，4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量帶非還原性末端的小分子纖維素。2、葡聚糖外切酶(1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucanase，E.C3.2.1.91，來自于真菌簡稱Cbh;來自于細菌簡稱Cex)，這類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)。3、β-葡聚糖苷酶(β-1，4-glucosidase, E.C3.2.1.21，簡稱BG)，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。
　　2 纖維素酶的分子結構與功能
　　纖維素酶分子普遍具有類似的結構，均由催化結構域(catalytic domains,CD)、纖維素結合結構域(cellulose-binding domains, CBD)和連接橋(linker)三部分組成。(1)催化結構域：呈球形，主要體現酶的催化活性及對特定水溶性底物的特異性。內切酶的活性位點位于一個開放的裂口(cleft)中，它可結合在纖維素鏈的任何部位并切斷纖維素鏈。外切酶的活性位點位于一個長環狀通道中，它只能從纖維素鏈的非還原性末端切下纖維二糖。(2)纖維素結合結構域：CBD在纖維素酶中位于肽鏈的氨基端或羧基端，通過連接橋與催化結構域相連。1995年，Tomme(1995)根據CBD分子大小及氨基酸的相似性將已知的CBD分成了10個家族，大部分的CBD位于家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。人們推測，CBD可能通過芳香環與葡萄糖環的堆積力吸附到纖維素上，由CBD上其余的氫鍵形成殘基與相鄰葡萄糖鏈從纖維素表面脫離開來，以利于催化區的水解作用。但有一些纖維素酶并沒有CBD，如熱纖梭菌是依靠纖維素酶系中的纖維小體(celluosome)吸附纖維素的。(3)連接橋：連接橋主要是保持CD和CBD之間的距離，也可能有助于不同酶分子間形成較為穩定的聚集體。細菌纖維素酶的連接橋富含脯氨酸、蘇氨酸，而真菌纖維素酶的連接橋富含甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。細菌纖維素酶的CBD與CD夾角為135度，而真菌為180度;細菌纖維素酶有兩個酶切位點可將CBD與連接橋分別切去，而真菌纖維素酶一般只有一個酶切位點可將CBD與連接橋一同切去。
　　3 纖維素酶的來源和生產
　　3.1 微生物來源
　　3.1.1 真菌源
　　所有能分解晶體纖維素的真菌，均能或多或少的分泌纖維素酶，所以纖維素酶的真菌性來源非常廣泛。目前研究和生產中采用的菌種大多是木霉、曲霉和青霉等。有人綜述了纖維素酶的來源，認為綠色木霉的得率最高。目前研究的熱點之一是通過對已知纖維素酶產生菌進行誘變，以增加產酶微生物菌種，國內外已有很多這方面的研究報道，如Mandels等(1971)通過綠色木霉QM6a獲得了QM9123，使活力提高一倍;上海植生所纖維素酶組采用野生木霉As3.3002和擬康氏木霉，經物理、化學因子誘變，獲得了高活力菌株Ea3-967和N2-78。利用基因工程手段也是提高纖維素酶產量和質量的重要方法。通過克隆出真菌的纖維素酶基因，將其與高效表達基因的啟動子和染色體起始位點融合則可表達，并且表達量增加;同時利用基因工程手段對纖維素酶分子進行改造，增加其活性并提高耐受性。
　　3.1.2 細菌源
　　能分解纖維素的細菌如纖維粘菌、熱纖梭菌及纖維桿菌等亦能分泌纖維素酶。但由于細菌分泌的纖維素酶量少(低于0.1g/L)，且產生的酶屬胞內酶或粘附在細胞壁上，難以進行工業化生產，所以很少用細菌作為纖維素酶的生產菌種。不過近年來國外利用纖維桿菌深層通氣培養生產纖維素酶效果較好。
　　3.2 動物性來源
　　反芻動物能消化纖維類飼料，主要由于其瘤胃內的微生物能分泌纖維素酶。因此可以利用瘤胃液獲得纖維素酶的粗酶制劑。國內外已進行了這方面的研究工作，但還沒能應用到規?；a中來。
　　3.3 工業生產
　　纖維素酶的都是通過發酵生產的。目前所用菌種主要是綠色木霉、李氏木霉、根霉、青霉、反芻動物(瘤胃細菌、真菌)、嗜纖細菌、產黃單孢菌、側孢菌等，其中綠色木霉應用最廣。纖維素酶是一類胞外酶，從培養物濾液中很容易得到，它又屬于誘導酶，在誘導物存在下才能大量產生。許多不溶性纖維素、可溶性纖維素衍生物、一些低聚糖及某些單糖和二糖均可作為誘導物。研究發現，在分批培養物發酵過程中，起初pH值最好是自然下降到3.0~3.5，再加以控制以防止pH降低，消耗纖維素后自然上升，這樣有利于酶的大量分泌。連續培養時保持pH=5.0可提高酶產量，因為低pH會抑制菌的生長。以前一些國家采用固體曲法生產纖維素酶，但此法難于監控，不利于現代化流水作業。因此現多采用液體深層發酵。在此基礎上又出現了流加培養法、分批發酵法、連續發酵法、二次發酵法及細胞循環法等。新近又在研究混合微生物發酵法。因為不同真菌的纖維素酶系在各組分均衡性方面有互補的現象，因此如將幾類菌混合在一起發酵，尋求使它們均能大量分泌纖維素酶的發酵條件和方法，就可以生產出優質高效的混合纖維素酶。
　　4 纖維素酶的作用機理
　　4.1 纖維素酶的降解機理
　　Reese在1980年提出了C1-CX假說，該假說認為由于天然纖維素的特異性必須以不同的酶協同作用才能將其分解。協同作用一般認為是內切葡萄糖酶首先進攻纖維素的非結晶區，形成外切纖維素酶需要的新的游離末端，然后外切纖維素酶從多糖鏈的非還原端切下纖維二糖單位，β-葡萄糖苷酶再水解纖維二糖單位，形成葡萄糖。一般認為，協同作用與酶解底物的結晶度成正比，當酶組分的混合比例與霉菌發酵液中各組分比相近時，協同作用最大，不同菌源產生的內切與外切酶之間也具有協同作用。
　　目前最易為人們所接受的纖維素酶降解作用機理為：
　　4.2 纖維素酶的營養作用機理
　　4.2.1 摧毀植物細胞壁，釋放胞內養分
　　植物細胞內的營養物質由植物細胞壁包裹，植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠組成。纖維素酶可在半纖維素酶、果膠酶等協同作用下破壞細胞壁，使細胞內容物釋放出來，以有利于進一步降解，提高吸收率，同時也增加了非淀粉多糖的消化進而改善了高纖維飼料的利用率。
　　4.2.2 補充動物內源酶的不足，剌激內源酶的分泌質的吸收
　　纖維素酶具有維持小腸絨毛形態完整，促進營養物質吸收的功能。
　　4.2.3 緩解或消除飼料抗營養因子的影響
　　果膠、半纖維素、β-葡聚糖及戊聚糖能部分溶解于水中，并產生粘性，增加了動物胃腸道內容物的粘度，對內源酶來說是一個屏障，降低了營養物質的消化吸收。而補充纖維素酶后，能在半纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖等的協助下將纖維素、半纖維素、果膠、戊糖等大分子物質降解為單糖和寡糖，從而降低粘稠度，促進內源酶的擴散，增加養分的消化吸收。
　　4.2.4 促進小腸對營養物
　　5 纖維素酶在畜牧生產上的應用
　　5.1 應用方法
　　由于植物細胞壁成分非常復雜，單一纖維素酶并不能很好的降解植物纖維素。在實際生產中通常將纖維素酶與半纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖酶等組成復合酶制劑，以取得更好的應用效果。目前，主要有兩種應用方法：(1)體外酶解法：把纖維素酶與秸桿或其他粗飼料拌勻后，在一定的溫度、濕度和pH值下堆積或密封發酵一定時間后，晾干或直接飼喂動物;(2)體內酶解法：把纖維素酶以添加劑的形式加入飼料中拌勻后飼喂動物，借助動物消化道的內環境而發揮作用。
　　5.2 應用效果
　　大量試驗研究表明，飼料中添加纖維素酶對各種動物的飼喂效果十分顯著。尹清強等在荷斯坦奶牛日糧中添加50g/頭的纖維素酶，使產奶量提高了8.9%，飼料轉化率提高10%。前蘇聯學者在綿羊日糧中加入0.25%的纖維素酶，可明顯提高日增重、粗纖維消化率和羊毛產量。許梓榮等(1999)在含30%麩皮的肉雞日糧中添加β-葡聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶，使日增重提高9.79%，飼料轉化率改善4.76%，干物質、粗纖維、粗脂肪和粗灰分的消化率分別提高10.58%、25.90%、21.76%和7.12%。秦江帆等(1996)在肉仔雞日糧中提高富含纖維的麥麩比例，并添加纖維素酶研究其效果，發現纖維素酶對肉仔雞的生長尤其是前期有明顯的促進作用。徐奇友等(1998)在13~20周育成期蛋雞日糧(含35%麩皮)中添加0.5%纖維素酶，使增重提高6.29%，飼料轉化率提高2.46%。Kee等(1985)在含20%麩皮的肉雞日糧中添加0.08%的纖維素酶，顯著降低了飼料消耗，改善了飼料轉化率。Qureshi等(1980)在大麥基礎飼料中添加0.08%的纖維素酶顯著提高了肉雞日增重。王鵬健等用含纖維素酶的復合酶制劑進行羅非魚喂養試驗，結果發現兩個試驗組增重分別比對照組提高18.6%和15.1%。此外，有人發現纖維素酶對治療草食動物胃腸疾病也有一定效果。陳俠甫等認為，纖維素酶對馬急、慢性消化不良、便秘、牛前胃遲緩、瘤胃膨脹、瘤胃積食等疾病有明顯療效。
　　6 纖維素酶在畜牧生產中應用存在的問題
　　6.1 添加量問題
　　雖然國內外有關纖維素酶應用的研究報道很多，但添加水平和結論并不一致。對于不同酶活性的產品、不同動物種類、不同生理階段以及不同飼料品種的適宜添加量并沒有明確，因此在實際應用中往往出現用量不當而影響應用效果。
　　6.2 單獨使用效果不明顯
　　植物細胞壁是一個極其復雜的體系，主要由纖維素搭成骨架，其中填充有大量半纖維素、果膠等物質，還有不少的木質素等，這些物質相互交融混合構成了極其復雜的結構體系，纖維素酶單獨使用難以將細胞壁徹底裂解，表現出效果不明顯。若搭配半纖維素酶、果膠酶等酶種使用則能取得較好效果。
　　6.3 纖維素酶對畜禽消化生理影響
　　飼喂纖維素酶后對于不同種類、不同發育階段動物消化酶系的變化及纖維素酶添加后對內源酶活力影響的研究不夠，這樣就難以合理地根據畜禽內源酶狀況補充其他酶組成復合酶制劑應用，以改變纖維素酶單獨使用效果不佳的狀況。
　　6.4 穩定性問題
　　纖維素酶是一種微生物制劑，對溫度、濕度、酸、堿等敏感，處理不當易失活，而對其進行穩定化處理的研究還不夠，也是導致飼用效果不穩定的因素。
　　7 應用前景
　　隨著人們對纖維素酶研究工作的深入，纖維素酶必將在食品、飼料、環境保護、能源和資源開發等各個領域中發揮越來越大的作用。如何加大對纖維素酶研究和開發的科技投入，改變目前纖維素酶生產規模小、工藝設備落后，菌種產酶性能不佳、穩定性差、生產成本高、技術水平低下的現狀，應盡快采用各種高新技術，加大纖維素酶應用研究工作的深度，這必將使纖維素酶得到更廣泛的應用，從而極大地促進我國畜牧業的發展。

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