兩大飼用淀粉酶制劑的研究進展

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兩大飼用淀粉酶制劑的研究進展

  
    中國飼料在線2006年8月10日報道:  基因工程技術在飼用酶制劑研究中的應用已成為酶制劑研究與生產的主要手段。本文簡單介紹飼用酶制劑的應用現狀、存在問題、重點對飼用蛋白酶與淀粉酶基因工程技術的研究進展以及酶制劑的應用前景等方面做了綜述，提出了一些觀點與看法。
    飼用酶制劑是指利用微生物技術生產的胞外酶，通常用作飼料添加劑，對于消除抗營養因子、提高資源利用率、開辟新的飼料來源以及解決畜牧業環境污染具有重要作用。近幾年，飼用酶制劑在農業生產上得到了廣泛應用，研究十分活躍，應用前景廣闊。

    目前，在酶的效力和投人產出比方面似乎仍有爭議。今后的研究，除注重酶在飼料中的應用條件及依據特定飼料組分而設計酶制劑外，重點是改進已生產的酶制劑的質量和效能，借助DNA重組技術以微生物、植物種籽及動物自身來生產酶，建立評估各種酶產品的標準程序，及在預測酶對各種動物和各種飼料效果的模式等方面加大研究力度。特別是基因工程技術在飼用酶制劑研究中的應用，已成為世界各國尤其是發達國家進行酶制劑研究與生產的主要手段。

    基因工程技術在飼料用酶中的應用主要包括兩個方面：（1）利用重組微生物反應器高效表達目的酶，降低生產成本。（2）利用基因工程技術改良飼用酶制劑，提高酶的質量與效率。隨著基因工程技術的發展，通過將部分微生物的基因改造，例如，通過基因工程手段，將酶蛋白的基本結構改變，強化酶在某方面的功能特性的這一做法已成為商業上成功的典范，然而，這種做法給酶制劑的應用帶來安全的隱患。所以，對經改造，尤其是經過基因技術改造的酶制劑，必須經過合理的、必要的安全評價才能工業化生產和應用。      

    蛋白酶研究進展

    蛋白酶是催化蛋白質水解的酶類，是農業上應用最多的酶制劑之一。蛋白酶制劑的種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，等等。蛋白酶廣泛存在于人和動物的消化道中，在植物及微生物中含量豐富。由于動植物資源有限，農業上用蛋白酶制劑主要通過微生物發酵來生產，所以飼用蛋白酶主要來源于微生物，生產蛋白酶的微生物種類很多，有細菌和真菌，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬（Penicillum），等等。

    在單胃動物飼料中添加蛋白酶主要有兩大作用，一是補充動物體內源蛋白酶的不足。幼豬和幼禽消化系統發育不完善，產酶不足，微生物活性較低，在飼料中添加蛋白酶就可以幫助幼齡動物對蛋白質的消化。二是消除抗營養因子的作用。飼料中植物性成分，特別是豆類植物，廣泛存在蛋白酶抑制劑和凝集素，它們對飼料營養價值有很大影響，不過對家禽而言，還有待進一步的研究。實驗表明，許多微生物蛋白酶可以降解動物消化道中對蛋白酶有抑制作用的蛋白酶抑制劑和凝集素，消除它們的影響，減輕這些因子的抗營養作用。

    反芻動物既能利用植物性蛋白也能利用動物性蛋白，大部分植物蛋白和全部的非蛋白氮被瘤胃中微生物分解，合成菌體蛋白，菌體蛋白被動物分泌的蛋白酶消化吸收。

    目前，通過基因突變來改良蛋白酶的熱穩定性的研究已取得了許多進展，Imanaka等提出一種通過定點突變增加蛋白酶熱穩定性的策略，他比較了來源于Bacillusstearothermophilus耐熱蛋白酶和Bacillusthermoproteolyticus的更耐熱的蛋白酶的氨基酸序列及高級結構，確定了可能進一步提高Bacillusstearothermophilus耐熱性的氨基酸殘基，Gly144位于a-螺旋中，將它替換成Ala（M1突變）后預期能提高α-螺旋的疏水性和穩定性，從而提高其耐熱性，反之，Thr66替換成Ser（M3突變）后則預期降低其耐熱性，試驗結果完全證實了這一設想。Yamashita等利用從一種毛霉Mucorpusillus中得到的Asp蛋白酶MPR為材料，將Ala101用Thr替換，Asp替換Gly186，然后，將突變的基因在釀酒酵母Saccharomycescerevisiae中表達。結果表明，這兩種突變，特別是Gly186處的突變造成酶的耐熱性顯著下降，如果讓這兩個突變發生在同一個分子上，酶的熱穩定性進一步下降。以上這些研究雖然還處于實驗室研究階段，但一正一反兩個例子充分說明了利用這種方法提高飼料用酶的耐熱性在理論上的可行性。

    許多微生物產生的胞外酶都是糖基化酶，寡聚糖與酶以N-糖基化或O-糖基化形式共價連接，也有一些是以非共價形式連接能夠通過各種物理方法將其分離。對于這些與胞外蛋白酶連接的寡聚糖，一般認為在分泌到細胞外的過程中可以保護酶受免疫蛋白酶水解及增強酶的可逆性，Tsujita從A.oryzea分離到一種酸性蛋白酶A1，A1又可以分離成兩個組分A1a和A1b，每一個組分的糖基化比例都是50%，試驗表明糖基化的酶對50%檸檬酸的變性作用有抵抗能力。根據這一特點，通過選擇不同的表達系統使酶的糖基化程度和類型改變，也可達到改善蛋白酶的性質。

    淀粉酶研究進展

    淀粉一般是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。主要用于飼料工業的淀粉酶有a-淀粉酶、支鏈淀粉酶、葡萄糖淀粉酶。支鏈淀粉酶的特點是，能專一性的切開支鏈淀粉和糖原等分支點的a1-6糖苷鍵，形成直鏈淀粉。所以將該酶與其他淀粉酶配合使用，可使淀粉完全糖化。微生物中產生支鏈淀粉酶的菌種非常廣泛，最早發現的是酵母菌，此外細菌如假單胞菌、芽孢桿菌、固氮菌以及某些放線菌。近年來支鏈淀粉酶作為淀粉酶中的一個新品種應用于飼料工業和食品工業。目前飼料中的主要成分是玉米，其中支鏈淀粉難以利用，造成飼料的浪費。如添加一定的支鏈淀粉酶，再在動物內源和外源淀粉酶的作用下，就能很好的消化吸收，提高飼料利用率，降低成本。

    由于飼料加工過程中的高溫階段及飼料中淀粉酶的主要作用場所為動物呈酸性的胃腸道，因此使得飼料用淀粉酶的基因工程改良研究與其他飼料用酶制劑一樣主要集中在酶的耐熱性與酸穩定性上。通過多年的努力，這一研究已經取得了一定進展。

    從80年代起，許多淀粉酶的研究工作集中在酶熱失活的機理上。導致a-淀粉酶熱失活的原因主要有兩種。第一種是高溫使得蛋白分子的構象發生變化，分子的有序結構變為雜亂無章。在pH為5.0、6.0、8.0，當溫度升高到90℃時，解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens中的α-淀粉酶會不可逆的失活，但當pH8.0時，若淀粉存在，可抑制酶失活。第二種也是更主要的一種原因就是在高溫下，Glu或Asp殘基會發生脫酰胺作用從而導致酶活性喪失，如地芽孢桿菌中a-淀粉酶熱失活的原因主要就是Glu或Asp的脫酰胺作用。與中溫酶相比，高溫酶具有額外的由2~3個特定Lys殘基構成的鹽橋。DNA重組技術為獲得熱穩定的淀粉酶提供了新思路。如嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）a-淀粉酶分子中第88位和第253位氨基酸殘基被Lys和/或Arg取代，可提高酶在高溫下的半衰期。同樣，當解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶分子中的第88、253和385位氨基酸殘基被Lys或Arg取代，其熱穩定性也有所提高。

    1999年，美國Mitchinson等人發表了一項專利，對a-淀粉酶的耐溫性和耐酸性進行了改良。研究的目的基因來源于地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）NCIB8061的a-淀粉酶編碼基因。利用基因突變技術，他們改變了酶的性質。突變主要包括三種：一種為188位Asn的定點突變；第二種為188位Asn及15位Met同時被其他氨基酸所替代；第三種突變不僅包括前兩種氨基酸替代，還有其他位點的氨基酸替代。目的基因經過定點突變后被轉化入受體菌--枯草芽孢桿菌中。研究發現，受體菌分泌的重組a-淀粉酶與原菌株表達的a-淀粉酶有耐溫性、耐酸性和有效性方面都得到了改良。例如，M15T/N188S突變的a-淀粉酶的活性較原始酶分別提高了2.1倍（可溶性底物）和1.7倍（淀粉底物）。M15T/H133Y/N188S三點突變的a-淀粉酶比活性提高了2.8倍；與原始a-淀粉酶相比，M15T/N188S突變的a-淀粉酶在酸性條件下具有更高的酶活性，當pH值下降到5.2時，原始酶已無活性，但突變a-淀粉酶仍然具有活性；突變酶降低了酶對Ca2+的依賴性等。突變a-淀粉酶這些性質提高了a-淀粉酶在飼料中應用的有效性，為飼料用淀粉酶的基因工程改良提供了新的思路。

    構建雜合基因也是一種有效的改良淀粉酶性質的方法，如Shibuya將來源于A.shirousamii的a-淀粉酶基因和葡萄糖淀粉酶基因雜合在一起，在釀酒酵母中表達出一個145kDa大的雙功能的融合蛋白，它同時具有a-淀粉酶活性和葡萄糖淀粉酶活性，大大提高了酶降解淀粉的有效性，但表達量僅有2.3mg/L。同年，Shibuya等將此雜合基因在米曲霉中表達，將表達量提高到500mg/L，比在釀酒酵母中的表達量提高了200倍。

    雖然通過基因工程對淀粉酶進行改良的大部分工作還處于實驗室階段，但其潛力已被科學家們所認可。

    隨著人們生活水平的提高及環境意識的增強，飼用酶制劑以其不產生殘留、無抗藥性、不污染環境等優勢將會進一步被推廣應用。飼用酶制劑既能提高飼料的消化率和利用率，提高禽畜及魚類的生產性能，又能減少禽畜排泄物中的氮、磷的排泄量，保護水體和土壤免受污染。當然，飼用酶制劑在研究及生產中的普遍應用還面臨著許多問題，我國政府也正積極通過禁止在飼料中使用抗生素、激素等方式來保障飼料和安全，維護生態平衡。但隨著生物技術特別是基因工程技術和生產技術的提高，都將逐步解決。因而飼用酶制劑作為高效、無毒副作用和環保型的“綠色”飼料添加劑，在21世紀將有著十分廣闊的應用前景。

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