鈣蛋白酶在骨骼肌生長及其嫩化中作用的研究進展

apple12151007

　　鈣蛋白酶在骨骼肌生長及其嫩化中作用的研究進展

　　宿永波，張勇

　　摘要：大量的研究表明鈣蛋白酶在蛋白質(zhì)降解方面起著重要的作用，為了提高骨骼肌的生長速度和家畜宰后的肉品質(zhì)人們對鈣蛋白酶系統(tǒng)的作用機理進行了大量的研究，研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶系統(tǒng)中的多種鈣蛋白酶與骨骼肌生長及宰后嫩化有很大的相關(guān)性，并在分子水平上作了更深入的研究。文章就鈣蛋白酶在骨骼肌生長及其嫩化中的作用的研究作一概述。
　　關(guān)鍵詞：鈣蛋白酶;骨骼肌;生長;嫩化
　　The Study Development of the Effect of Calpains in Skeletal Muscle and Meat Tenderness
　　ABSTRACT: Amount of researchs show that calapins has palyed an important role in the protein degradation. In order to increase the skeletal muscle growth speed and meat quality after slaughtering, lots of scientists do amount of researchs on the mechanism of calpains system and find that a variety of calpains in calpain system have great relevance with the growth of skeletal muscle and its tenderness, and do more in-depth researchs at the molecular level. The article overview the study of the effect of calpains in skeletal muscle and meat tenderness.
　　Key words: calpain; skeletal muscle; growth; tenderness
　　骨骼肌生長速度最終取決于骨骼肌細胞的數(shù)量、肌肉蛋白合成速度和降解速度。激素注射、飼料添加劑的使用、營養(yǎng)狀況和飼養(yǎng)管理等都能通過調(diào)節(jié)以上三個基本因素中的一個兩個或三個而影響整體蛋白質(zhì)的沉積速度，從而影響肌肉生長速度。骨骼肌蛋白降解速度相對降低或蛋白合成的速度相對升高都會導(dǎo)致肌肉生長速度的增加，也會提高攝人營養(yǎng)物質(zhì)的肌肉轉(zhuǎn)化效率。依賴鈣的鈣蛋白酶途徑骨骼肌蛋白降解的一種非常重要的途徑。肌原纖維蛋白質(zhì)降解的第一步是肌原纖維解裝配成肌絲，這一步可能是肌原纖維蛋白質(zhì)降解過程中限速的一步。大量的研究表明鈣蛋白酶系統(tǒng)參與這一解裝配過程。近年的研究表明，calpain是細胞質(zhì)中主要的蛋白水解酶，在肌原纖維蛋白降解中起著重要的作用。肌肉增長和宰后嫩度的變化與蛋白質(zhì)水解程度密切相關(guān)。因此鈣蛋白酶的活性會影響畜禽肌肉增長和肉的嫩度，并對肉質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。
　　1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu)
　　1.1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu) 鈣蛋白酶(EC3,4,22,17)是細胞內(nèi)依鈣中性半胱氨酸內(nèi)肽酶。在體內(nèi)，通過Ca2+激活及自溶而表現(xiàn)出蛋白水解酶的活性，并通過鈣蛋白酶抑制蛋白抑制活化的鈣蛋白酶的活性。鈣蛋白酶系統(tǒng)主要作用對象是細胞骨架蛋白，蛋白激酶和磷酸酶以及激素受體。廣泛存在的鈣蛋白酶有兩種，鈣蛋白酶1(u-calpain)和鈣蛋白酶2(m-calpain)還有鈣蛋白酶3(p94).前兩者都由兩個亞基組成，分子量相近，但兩者表現(xiàn)半最高活性所需的Ca2+濃度不同。u-calpain所需的Ca2+為1~12umoL/L而m-calpain所需的鈣離子為250~750u moL/L。它們的小亞基相同，而大亞基是兩個相關(guān)基因的產(chǎn)物，兩種大亞基之間存在一定的免疫交叉反應(yīng)。有功能的鈣蛋白酶是由大亞基(催化區(qū)，80kd)和小亞基(調(diào)節(jié)區(qū)，30kd)組成，小亞基是單個基因的產(chǎn)物，而大亞基則是不同基因的產(chǎn)物。不同來源的鈣蛋白酶cDNA序列發(fā)現(xiàn)其大亞基由四個結(jié)構(gòu)域組成，其中結(jié)構(gòu)域Ⅱ是表現(xiàn)水解活性的關(guān)鍵部位，它約占大亞基氨基酸殘數(shù)的35%左右;結(jié)構(gòu)域Ⅳ，位于羧基端，占氨基酸殘基數(shù)的20%，是鈣離子結(jié)合部位，與其它鈣結(jié)合蛋白如鈣調(diào)素蛋白(CaM)有明顯的相似性，含有四個EF-手結(jié)構(gòu);結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域Ⅲ分別占氨基酸殘基數(shù)的10%和35%，可能起活性調(diào)節(jié)作用。小亞基含兩個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域Ⅱ和大亞基的結(jié)構(gòu)域Ⅳ很相似，類似于CaM，也有四個EF-手結(jié)構(gòu)。calpain3(p94)也是一個與肌肉的嫩度密切相關(guān)的蛋白酶，其結(jié)構(gòu)如下圖1。
　　
　　2 鈣蛋白酶的活性調(diào)節(jié)
　　2.1 鈣蛋白酶活性的激活調(diào)節(jié) 細胞中鈣蛋白酶活性受到Ca2+和鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)還有鈣蛋白酶激活蛋白(calpain activator)的調(diào)節(jié)，其中calpain activator是calpain的正調(diào)節(jié)因子。提高Ca2+濃度，鈣蛋白酶的活性增強。Ca2+濃度進一步提高將導(dǎo)致構(gòu)象變化而表現(xiàn)蛋白水解酶活性。當(dāng)鈣蛋白酶被Ca2+激活后，如果附近有鈣蛋白酶抑制蛋白存在，將迅速與之結(jié)合，而抑制蛋白酶活性，從而保證鈣蛋白酶對底物只進行局部的特定位點的水解。由于激活鈣蛋白酶所需的Ca2+濃度大于1umol/L，而胞內(nèi)的Ca2+為0.2~0.8umol/L，不足以激活鈣蛋白酶。在活體中，鈣蛋白酶如何被激活一直是一個令人困惑的問題。有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)calpain activator存在時，即使在正常生理狀態(tài)的[Ca2+]條件下，calpain也能發(fā)揮它的蛋白酶水解活性。目前發(fā)現(xiàn)的鈣蛋白酶激活蛋白有兩種，一種是UK114，另一種是ACBP-酰基輔酶A結(jié)合蛋白，前者是calpain1的激活因子，后者是calpain2的激活因子。這種激活蛋白可能是一種激酶，它使鈣蛋白酶分子的特定位點磷酸化而使鈣蛋白酶對Ca2+的親合力提高，也可能通過與鈣蛋白酶結(jié)合而起活化作用，而活化蛋白本身受磷酸化和去磷酸化的調(diào)節(jié)。目前牛羊的UK114的cDNA序列已經(jīng)得到克隆。calpain是鈣依賴蛋白酶，只有在Ca2+激活的狀態(tài)下才具有活性，當(dāng)calpain的大小亞基相結(jié)合時，它不具有活性。Yoshizawa等(1995)發(fā)現(xiàn)calpain小亞基(30kd)主要起調(diào)節(jié)的作用，大亞基(80kd)起催化調(diào)節(jié)作用。在表現(xiàn)水解活性時，大致發(fā)生以下4個過程的變化：calpain大小亞基的分離;小亞基的自溶，30kd亞基迅速降解為17kd;大亞基自溶，80kd轉(zhuǎn)化成78kd再變成76kd;calpain構(gòu)象發(fā)生變化而表現(xiàn)蛋白水解酶活性;calpain受激活后呈自溶狀態(tài)，從而表現(xiàn)活性。由于calpain在自溶后才表現(xiàn)活性， 因此calpain可以看成是一個酶原，若calpain活性下降則表明其在水解中所起的作用。calpain受濃度調(diào)控，高Ca2+濃度能加速calpain的活化。除了Ca2+濃度，calpain的活性還受離子強度、pH、底物等因素的影響。
　　2.2 鈣蛋白酶抑制蛋白的抑制調(diào)節(jié) calpastatin是高效的，十分專一的calpain活性抑制劑，并且在大多數(shù)組織中，calpastain的濃度可抑制calpain的活性，當(dāng)calpain被Ca2+ 激活后，如果附近有calpastatin存在，將迅速與之結(jié)合，影響u-calpain的自溶穩(wěn)定性，抑制calpain活性，從而保證calpain對底物只進行局部的特定位點的水解(Roman等,1999)。鈣蛋白酶抑制蛋白與鈣蛋白酶結(jié)合后，降低calpain的活性，可能起到防止鈣蛋白酶被隨機激活的作用，另外Huang J等(1998)和E.F.Delgado等(2001)發(fā)現(xiàn)calpastatin在宰后肌肉中也會發(fā)生降解，且降解后的calpastatin同樣具有抑制calpain活性的作用。一些抑制劑可以以共價鍵的方式與酶的巰基牢固結(jié)合，而使酶失去活性，如碘乙酰胺、碘乙酸、E-64等可對calpain發(fā)生不可逆抑制作用。u-calpain和m-calpain作用于底物的特異性切割位點基本是一致的，calpain切割位點P1最佳為精氨酸Arg、組氨酸His、酪氨酸Tyr，P2最佳為亮氨酸Leu殘基，且P2被認為是決定位點(Dorothy EC,1991)。根據(jù)這些特性，人工合成一些多肽以抑制calpain的活性，如leupeptin、三肽氯甲基酮，它們在P2位點都含有亮氨酸，對calpain發(fā)生競爭抑制作用。
　　3 鈣蛋白酶在骨骼肌生長中的作用
　　骨骼肌鈣蛋白酶存在于肌細胞內(nèi)部，在Z線中濃度最高。快速萎縮肌肉鈣蛋白酶活性是正常的數(shù)倍，它的一個特征是Z錢的降解，而肌動蛋白和肌球蛋白保持完整。體外試驗表明，肌原纖維用純u-calpain或m-calpain并在Ca2+存在下培養(yǎng)，Z線完全消失，肌原纖維釋放出肌絲，在鈣蛋白酶抑制劑存在下，釋放出的肌絲比率下降。哺乳動物骨骼肌肌原纖維呈圓柱狀，直徑1~3um，高1~40mm，而溶酶體或胞質(zhì)蛋白酶的直徑約16nm，高約11nm。因此，肌原纖維蛋白質(zhì)降解的第一步必須是肌原纖維解裝配成肌絲。大量研究表明，鈣蛋白酶系統(tǒng)參與這一解裝配過程。鈣蛋白酶引發(fā)肌原纖維蛋白質(zhì)降解的可能機制如下：鈣蛋白酶使Z線(使細肌絲固著于肌原纖維)和肌聯(lián)蛋白、伴肌動蛋白(使粗肌絲和細肌絲固著于肌原纖維)降解，肌原纖維釋放出肌絲。細肌絲的肌原蛋白和原肌球蛋白以及粗肌絲的C-蛋白降解，粗肌絲和細肌絲分別解離出肌球蛋白和肌動蛋白。釋放出的粗肌絲和細肌絲可與母體或其他肌原纖維重新裝配，也可被胞質(zhì)蛋白酶或溶酶體組織蛋白酶降解成氨基酸。肌原纖維的殘留部分功能完整，收縮力量減弱。
　　研究表明，calpain的作用可能僅在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解過程中起調(diào)節(jié)作用，而并非整個降解過程的直接參與者。體外試驗表明，calpain能降解肌原纖維骨架蛋白，如結(jié)合蛋白(desmin)、絲蛋白(filamen)、原肌球蛋白(tropomyosin)、肌原蛋白T(troponin-T)、連接蛋白(titin)、nebulin、vinculin等，但不降解α-肌動蛋白(α-actin)、肌球蛋白(myosin)及α-輔肌動蛋白(α-actinin) 。因此推測calpain可能通過對肌原纖維蛋白進行特異的局部降解而對其結(jié)構(gòu)、功能進行調(diào)控。calpain導(dǎo)致肌肉降解可分為兩步：首先其攻擊肌原纖維的肌節(jié)(兩個相鄰Z盤之間的一段肌原纖維)部位，釋放肌絲使降解為小片段，然后被溶酶體所捕獲而進一步降解。calpain主要集中于Z盤，因此認為，降解從此處開始。但近期研究發(fā)現(xiàn)，calpain首先水解的是N2線，據(jù)報道N2線是titin和nebulin絲蛋白所在區(qū)域，它們分別連接粗肌絲和細肌絲，最終通過I帶伸向Z盤。在降解N2線的同時也會降解一些骨架蛋白如desmin，使肌纖維釋放肌絲。細肌絲的肌原蛋白和原肌球蛋白及粗肌絲的C-蛋白降解，分別解離出肌球蛋白和肌動蛋白。釋放出的粗肌絲和細肌絲可與母體或其它肌原纖維重新裝配，也可被胞質(zhì)蛋白酶或溶酶體降解。calpain參與骨架蛋白的降解是這蛋白質(zhì)水解過程中的限速步驟。楊曉靜等實驗發(fā)現(xiàn)，對豬注射重組生長激素處理后，背最長肌calpain3mRNA的表達有上升趨勢，半腱肌中calpain3mRNA的相對豐度顯著上升，在肌肉增長的過程中calpain3也可能參與蛋白的降解。
　　4 鈣蛋白酶在肌肉嫩化中的作用
　　鈣蛋白酶系統(tǒng)與肉的嫩度的關(guān)系，嫩度主要決定于肌纖維、肌節(jié)長度、肌內(nèi)脂肪和結(jié)締組織等。哺乳動物肌纖維在胚胎形成過程中受到MyoD家族的調(diào)控，MyoD家族包括MyoDI、肌細胞生成素(myogenin，MYOD)、myf-5和myf-6。它們通過調(diào)節(jié)肌肉分化階段特異性蛋白的表達來參與肌細胞的分化。MyoD基因控制啟動成肌細胞融合和肌纖維形成，在肌肉分化過程中起關(guān)鍵作用。Esson Gustavsson(1993)研究發(fā)現(xiàn)肌纖維的數(shù)量在出生時就決定了，生后肌纖維生長只限于肌纖維長度和橫切面積的增長;同時發(fā)現(xiàn)肌肉品質(zhì)受到肌纖維類型和直徑的影響，并用肌球蛋白ATP酶可將肌纖維分為三種類型，即1、IIA和IIB型。紅肌(即I型纖維)較白肌(即Ⅱ型纖維)的纖維含量多，肌纖維細，肌肉較嫩。FJ.Naya.等(2000)研究表明。鈣調(diào)磷酸酶與骨骼肌纖維特化調(diào)控有關(guān)，可使C2C12肌細胞l型纖維基因上調(diào)，并通過劑量依賴性方式將II型肌纖維轉(zhuǎn)變?yōu)镮型肌纖維，鈣調(diào)蛋白激酶(CaMK)與鈣調(diào)磷酸酶協(xié)同作用，激活I(lǐng)型纖維基因在培養(yǎng)的肌細胞中表達。肌原纖維的狀態(tài)對嫩度具有決定的作用，肌原纖維越碎裂、越舒張，剪切力越低，嫩度越好(陳代文等，2001)。嫩化是尸僵發(fā)生后一定時間內(nèi)，肌纖維碎裂，肌肉重新變軟，嫩度增加的過程。鈣蛋白酶系統(tǒng)在細胞內(nèi)參與機體生長與代謝過程，還在肌原纖維更新和宰后嫩化中扮演重要角色。calpain表達減少以及calpastatin表達量的增加，都會導(dǎo)致肌肉蛋白水解率及宰后肉嫩度的下降，這表明calpain水解作用是導(dǎo)致肉嫩化的主要因素。在宰后嫩化的過程中m-calpain的活性幾乎不變，而u-calpain的活性顯著下降，鈣蛋白酶活性下降則是其發(fā)揮水解作用的體現(xiàn)。由于活體宰后Ca2+濃度可以激活u-calpain而不能激活m-calpain，大量的研究表明在肌肉的熟化過程中u-calpain的活性增高，含量急劇下降，因此u-calpam被認為是改善肉質(zhì)嫩度的候選基因。Morgan等(1993)和Koohmaraie等(1996)認為u-calpain是肉嫩化的基本酶類。Ilian等(2001)研究發(fā)現(xiàn)肉的嫩度與u-calpain的活性具有相關(guān)性。calpastatin可抑制鈣蛋白酶的活性，降低蛋白質(zhì)水解，但鈣蛋白酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)肌肉嫩化的具體機制還不甚清楚。
　　5 結(jié)論
　　家畜整體蛋白質(zhì)的增加受兩個過程制約：整體蛋白質(zhì)合成和整體蛋白質(zhì)降解，控制蛋白質(zhì)降解和合成可以提高肌肉生長速度。許多研究表明，calpain在肌原纖維蛋白的降解，特別是在早期肌肉轉(zhuǎn)化過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，抑制其活性有可能可以抑制蛋白質(zhì)的降解從而提高肌肉生長。但是現(xiàn)有的抑制劑除抑制calpain的活性外還或多或少的抑制其它蛋白酶的活性，缺乏專一性。而calpastatin是高效的，十分專一的calpain活性抑制蛋白，因此可以通過基因調(diào)控技術(shù)提高其在肌肉組織中的表達來抑制calpain的活性，從而達到提高肌肉生長的目的。我們可以重組DNA技術(shù)超表達鈣蛋白酶抑制蛋白或有缺陷的鈣蛋白酶，然后研制細胞系，鈣蛋白酶抑制蛋白或鈣蛋白酶的超表達均可能在其中被肌肉特異啟動子啟動，從而控制肌原纖維蛋白質(zhì)降解以加快蛋白質(zhì)積累。而且肉的嫩化與calpain的活性有關(guān)，因此可以通過激活calpain或降低calpastadn活性的方式提高肉的嫩度，改善肉質(zhì)。也就是說可以在家畜生長階段提高calpastadn的活性來抑制calpain的活性促進蛋白質(zhì)的沉積，提高骨骼肌的生長速度，在屠宰前提高calpain的活性以增加骨骼肌的嫩度。但總的來說鈣蛋白酶系統(tǒng)的具體調(diào)控機理還不很清楚，還需要利用分子生物學(xué)等技術(shù)手段進行深入的研究。
　　參考文獻
　　[1]楊群輝,張勇. 鈣中性蛋白酶系統(tǒng)的研究進展.中國畜牧獸醫(yī),2004.31(6):10~12.
　　[2]金海麗,許梓榮.鈣蛋白酶系統(tǒng)改善肉嫩度的機理及其應(yīng)用.中國飼料,2002(19):8~11.
　　[3]許梓榮,等.鈣蛋白酶系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、活性調(diào)節(jié)及其在骨骼肌生長中的作用.中國畜牧雜志,2002,38(2)44~46.
　　[4]劉壽春,種賽意. 肉品嫩化理論及嫩化方法的研究進展.肉品衛(wèi)生,2005(7):25~28.
　　[5]隋立森,等.依鈣蛋白酶及其抑制劑的研究近況.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2000,34(3):230~23 2
　　[6]陳代文,張克英,胡祖禹.豬內(nèi)品質(zhì)特征的形成原理[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,20(1):60~
　　66.
　　[7]徐衛(wèi)丹,等.鈣蛋白酶系統(tǒng)在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用.飼料研究,2005(4):13~15.
　　[8]廖洪波,等. 鈣蛋白酶和肉的成熟嫩化.肉類工業(yè),2003(8):27~29.
　　[9]杜敏,等.生物化學(xué)與生物物理進展.1998, 25 (1) : 26～ 30.
　　[10]汪超,張曦. 鈣蛋白酶在肉嫩化過程中的作用.中國畜牧獸醫(yī),2005,32(9):9~11.
　　[11]單體中,汪以真.鈣蛋酶系統(tǒng)研究進展.中國飼料,2006(7):2~5.
　　[12]王金勇,白小青,等.鈣蛋白酶系統(tǒng)對肉質(zhì)嫩度的改善.四川畜牧獸醫(yī),2004,31(162):34~35
　　[13]Delgado EF,Geesink G H,Marchello J A,et al.The calpain systerm in three muscles lf normal and callipyge sheep[J].J Anim Sci,2001,79:398~412.
　　[14]Delgado EF,Geesink G H,Marchello J A,et al.The calpain systerm in three muscles lf normal and callipyge sheep[J].J Anim Sci,2001,79:2097~2107.
　　[15]Ilian M A,Morton J D,Bekht A E,et al.Effect of preslaughter feed withdrawal period on longissimus tenderness and the expression of calpains in the ovien [J]Agric Food Chem,2001, 49(4):1990~1998.
　　[16]Huang J,Nei E F.Role of calpain in skeletal-muscle protein degradation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:12100~12105.
　　[17] Koohmaraie M,Shackelford S D,Wheeler T L,et al.Amuscle growth and meat quality traits [J].Anim Sci,1995,73:3596~3607.
　　[18]Rami A,Agarwal R,Botez G,Winckler J.u-calpain activation,DNA fragmentation,and synergistic effects of caspase and calpain inhibitoes in protecting hippocampal neurons form ischemic damage[J]Brain Res,2000,866:299~312.
　　[19]Pringle T D,Harrelson J M,West R L,et al,Calaium-activated tenderization of strip loin,top sirloin,and top round steak in diverse genotypes of cattle[J].J Anim Sic Dec,1999,77:3230~ 3237.
　　[20] Geert LG, Mohammad K. Effect of calpastatin on degradation of myofibrillar proteins by u-calpain under postmortem conditions[J]. J Anim Sci,1999,77:2685-2692.

sjs-6310

肉品質(zhì)是以后研究的熱點,這點必須引起關(guān)注