化驗工作方法的驗證

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檢定方法的驗證
一個實驗室在建立一個新方法或第一次使用一個新方法時，都要對該方法的適
用性和可靠性進行測定，這就是驗證。驗證就是證明某一程序、生產過程、設備、
物料、活動或系統確實能達到預期結果的有文件證明的一系列活動(1)。WHO 在1992
年的GMP 中對驗證的定義是能證明任何程序、工藝、設備、物料、活動、或系統確
實能導致預期結果的文件證明的行為（2，3）。
在我國GMP 文件中明確指出，藥品生產驗證包括廠房、設施及設備安裝確認、
運行確認、性能確認和產品驗證。因此，在使用前均應對檢定方法、儀器、設施
系
統（如：空氣、水、蒸汽）、工藝（如：生產工藝、清掃、滅菌、無菌分裝、凍
干）
等進行驗證。對于部分和整體的驗證的要求是不同的，如對于凍干機的驗證和凍
干
過程的驗證是不同的；清掃玻璃器皿和清掃設施的驗證也是不一樣的；對滅菌過
程
和無菌試驗也要采用不同的驗證要求。對于一個過程來講，對其中每一部分的驗
證
應不同，如一個試驗、試驗中的試劑和儀器的驗證要求是不同的。
一、 驗證的分類
一般根據產品和工藝、方法的要求以及設備變更、工藝修訂等特點可以把驗證
分為4 種類型。
1.前瞻性驗證：
前瞻性驗證就是在方法正式投入使用前按照預定的方案進行研究，來收集實驗
數據，以證實檢定方法達到預期要求的行為。該驗證方法是一種最好和常用的驗
證
方法。
2.同步驗證：
就是已經在生產中實施的某項工藝運行中同時進行的驗證。在這種情況下驗證
數據的收集來源于工藝的實際運行過程中，一般要通過幾次運轉才能獲得足夠的
數
據來證明工藝的可靠性。采用這種驗證方式的先決條件是：
- 有完善取樣計劃，即生產及工藝條件的監控比較充分；
- 有經過驗證的檢定方法，方法的靈敏性及特異性/選擇性比較好；
- 對所驗證的產品或工藝已經有相當的經驗及把握。
3.回顧性驗證：
如果某一產品已經生產了很長一段時間，但沒有按照前瞻性驗證的要求進行過
驗證，而又不能進行同步驗證（如儲備的原液可以使用幾年或設備正用于其他的
用
途），此時可以采用回顧性驗證。通過對產品、生產步驟和檢驗步驟進行檢測和
分析，
以證明生產步驟和生產工藝的一致性和完整性。一般不采用這種驗證方式。對于
檢
定方法，如果有足夠的數據也可以采用這種驗證方式。
4.再驗證：
當影響產品質量的主要因素，如工藝、質量控制方法、主要原輔料、主要生產
設備等發生改變時，以及生產一定周期后，應進行再驗證。它是旨在證實已驗證
狀
態沒有發生漂移，表明該工藝仍能達到預定的要求。
一旦一個系統或一個工藝得到了驗證，在操作過程未發生改變時，則認為達到
了原定的要求。當發生改變、或出現錯誤、或更換設備或設備位置發生改變時，
則
需要進行再驗證。
驗證分三個級別(1)除建立方法的實驗室外還有二個或二個以上的實驗室進行驗
證；(2)除建立方法的實驗室外還有一個實驗室進行驗證；(3)只有建立方法的實
驗室
進行驗證。理論上講所有的方法都應進行協作研究的驗證，雖然做起來非常困難，
一般情況下也沒有這樣做，然而應朝這一方向努力。對于一個方法只需進行一次
驗
證，如果對方法進行了修改或擴大了應用范圍，都需要進行再一次的驗證。
若采用體外法來代替體內的效力試驗，則需要在一開始驗證時就應測定一個低
效價的疫苗，以便在早期就確定此新方法可以區別合格的和合格線以下的制品。
驗證實驗也要證明在最差狀態下操作時，系統仍能達到原預定要求。
二、檢定方法的驗證
檢定方法的驗證就是根據方法的需要測定該方法的準確性、精密性、直線性、
測定范圍、測定限度、測量限度、特異性和耐用性（或可靠性）等幾個指標中的
一
個或幾個(4)。對于理化測定方法已有了確定的要求和判定標準（5-10），而生
物學
測定的結果具有更大的可變性，一般要使用動物或細胞，這些有機體本身就具有
較
大的可變性，因此生物學測定的要求和合格標準要松一些。
1．檢定方法的種類
測定生物制品的方法一般可分為三大類，即結合試驗、細胞測定試驗和動物試
驗，對某些復雜的方法同時需要以上二種類型的測定方法。
1）、結合試驗：
是指包括2 個或多個分子間結合的實驗。免疫結合即是一例，結合試驗一般用
于純化過程的監測或清潔的驗證試驗。由于在結合試驗中測定的分子不一定都是
具
有生物活性的分子，所以它一般不用作制品的效力測定。一般講結合試驗結果的
變
化在5～20%間。
2）、細胞測定試驗：
是指制品可以誘導細胞產生可測定的應答，如細胞聚集、裂解、融合或產生特
異的化學物質。細胞測定試驗比結合試驗具有更大的可變性，因此應精心操作以
保
證試驗結果的一致性。細胞測定常用于制品的效力測定。一般講細胞測定結果的
變
化在50%以上。
3）、動物試驗：
更復雜并且包括飼養、管理和操作動物。它需要時間長并且具有更大的可變性，
一般測定一個藥物的生物活性是通過與已知的標準品或未處理（未免疫）的動物
進
行比較而得。一般用于熱原質、一般安全試驗和效力試驗。由于試驗成本高，使
用
動物數目多費時和可變性大，因此動物效力試驗一般用于成品簽發時的測定。一
般
講動物測定結果的變化在50%以上。
在驗證過程中，應根據試驗用途來確定驗證哪些參數。WHO 和一些管理部門及
藥典已經出版子許多關于分析方法驗證的一些要求（4-10）。
一般國家檢定實驗室使用的檢定方法分為以下4 種。
1)、標準方法：
是指已經被多家實驗室進行了廣泛的研究，盡管某些方法可能是一個比較老的
方法，但一般認為是最佳的實驗方法。這類方法都進行了徹底的研究和驗證。
2)、正式的方法：
是指政府部門或國際組織（WHO、國家管理當局或藥典）要求國家檢定實驗室
使用的方法，這些方法在被確定為正式方法以前，也經過了適當的驗證。
3)、來自參考文獻的方法：
是指在專業雜志上發表并介紹的方法，一般要認真對待這類方法，并需要進行
徹底的驗證。
4)、自己建立的方法：
是指為了提高檢測方法或為了達到某一特定要求而開發的或對原方法進行了修
改的方法，這類方法需要進行嚴格的驗證。
如果某實驗室需要采用已經過徹底驗證的標準方法和正式方法，在第一次應用
前需要進行驗證以證時實驗操作達到了要求。如果采用新開發的或修改了的方法
作
為常規檢定方法，除需要進行一系列的驗證外，同時還應考慮以下幾個問題：
(1)該方法是否達到了特定的要求？
(2)該方法的靈敏性、重復性、準確性和精密性方面是否達到了要求？
(3)該方法在技術上是否要求很苛刻？
(4)實驗室是否具有應用該方法的專業知識？是否需要培訓？
(5)該方法是否需要特殊的設備？
(6)該方法是否造價很高？
(7)該方法是否需要時間過長？
2．驗證時應考慮的問題
首行要確定方法的適用性，該方法首先可以得到可重復的、可信的實驗結果，
要考慮在以下幾個參數：準確性、精確性、靈敏性、特異性和耐用性（可靠性）。
第
二，要與已知的方法進行對比試驗，以考查二者間的相互關系。
如果在該實驗室內無可對比的老方法，則首先建立標準的方法，用含一定范圍
濃度的樣品進行測定，以標準方法所得結果作為標準，用統計學的方法進行對比
處
理，得出二種方法間的相關系數。對于一個新建立的方法則需要進行協作研究對
其
適用性進行驗證。
3．驗證中需測定的參數
驗證實驗中需對以下幾個參數進行測定。
1）、準確性（accuracy）
表示測定值與真實值之間的一致性或接近的程度。一般采用填加和回收試驗來
測定準確性，即將已知量的樣品加到空白中進行測定，比較測定值與真實值之比。
準確性一般表示為偏差（bias）或測定值與真值之間的錯誤率（回收率）（即測
定值
/真實值×100%）。一般對于生物制品而言，因為沒有純的標準品，所以準確性
不太
實用。生物制品測定時一般與同時進行的參考品進行比較而得，此時的合格標準
一
般是測定出的參考品值的合格范圍或樣品與參考品之間的比值。
2）、精密性（precision）
表示測定值之間的一致性或接近的程度，一般表示為變異系數(CV%)，變異系數
即是測定值的標準差與測定值的比值。精密性分幾種：一種是實驗內的精密性（即
重復性 repeatability），它是在同一次試驗內同一個樣品多次測定結果間的變
異系數。
另一種是實驗間的精密性（或叫intermediate precision），它是在同一實驗
室內不同
次試驗間對同一樣品多次測定結果間的變異系數。實驗室之間的精密性即重現性
(reproducibility)，一般可通過協作研究得到，此參數不適合生產設施的驗證。
3）、耐用性（robustness/ruggedness）
是通過有效地改變實驗方法的參數，來測定此改變對試驗結果的影響，即實驗
結果不受影響的承受程度。參數的改變可以是室溫或培養溫度，或濕度、或改變
培
養時間，或對試劑的pH 進行較小范圍的調整等。在每種試驗條件下，對準確性、
精密性、或其他參數進行測定，以確定試驗方法的耐受或承受能力。
4）、直線性（linearity）
是測定結果與樣品中測試物濃度的正相關性，該參數的測定將確定檢測方法的
測量范圍，它可以表示為回歸直線的斜率和離散性，或者相關系數R 和測定系數
R2 。
5）、測量范圍（Range）
是指當準確性和精密性都能達到要求時所能測得的樣品中待檢物的最高濃度，
它就是測定直線性的上限，如果劑量和反應間的關系不成直線，測量范圍可以通
過
校正曲線來測得。
在《中華人民共和國藥典》中規定測量范圍是指能達到一定精密度、準確性和
直線性，測定方法適用的高低限度或量的區間（11）。
6）、選擇性/特異性（Selectivity/Specificity）
是指當檢測方法對測試樣品中含有制品中應有的其他化合物時，測定待測物的
能力。本參數用于鑒別試驗、濃度或效力試驗和純度試驗的測定，以確定使用該
檢
測方法所測定的結果是否準確地反映了制品的鑒別、效價或純度。選擇性（特異
性），
就象準確性一樣，一般用偏差或測定值與已知值之間的錯誤率（%）來表示。
7）、測定限度（Limit of Detection）
是指能夠測定出的樣品中測試物的最低量。該量并不一定要定量測出其準確的
含量或濃度，它是檢查限度實驗中最重要的一個參數。
8）、測量限度（Limit of Quantitation）
是指在準確性和精密性都能達到要求時能夠定量測定出的樣品中測試物的最低
量。LOQ 是檢查測定藥品中不純物方法的一個參數。
根據WHO 關于測定方法驗證試驗的文件，用于不同檢定目的的實驗方法需進
行不同參數的測定。下表給出了不同檢定方法需驗證的參數。
不同測定方法應進行的驗證的參數
雜質檢查 參 數 鑒別試驗
定量 限度
效價測定 組成測定
準確性 + + +
精確性 + + +
耐用性 + + + + +
直線性和測定范圍 + + +
選擇性（特異性） + + + + +
測定限度 + +
測量限度 +
另外，由于生物測定的持續性、復雜性、以及參考品和樣品貯存時間較長的特
性，除了上述驗證參數外，對于生物測定有另外幾個參數也非常重要，包括：
1)、試驗順序（front-to-back test）的影響：它是測定在一個較復雜的試驗中，
先測和后測對試驗參數的影響。這是由于它們相對于對照品的測定時間不一樣而造
成的。
2)、凍融穩定性的影響：將樣品反復凍融，以確定對測定結果的影響。
3）、批間的精密性：測定不同批細胞、血清、或其他具有較高變化性的物質對
測定方法精確性的影響。
4．驗證實驗中參數測定的具體操作和要求
1）、準確性：
對于某些尚無純品的生物測定來說可能不適用。對于某些已達到敏感性和特異
性要求的方法來說可以不測定該參數。下述方法只適用于免疫分析。
目的：確定該方法測量預定值的能力。
步驟：至少配制3 個不同濃度填加到空白中的測試物
每一濃度配制2 份樣品
每1 次試驗對6 份樣品重復測定3 次
比較測定值和真實值
求出回收率（%），即偏差
2）、精密性
（1） 試驗內精密性
目的：確定在同一個試驗內同一個樣品在測量范圍內的不同濃度時測定的精密
性。
步驟：配制3 個稀釋度的樣品（測量范圍內的高、中、低濃度）
每一個稀釋度重復測定10 份（同一試驗內）
計算每一濃度測定結果的均值和SD
計算每一濃度的CV 值
（2） 試驗間精密性
目的：確定在不同試驗間對測量范圍內同一個樣品在不同濃度時測定的精密性。
步驟：配制3 個稀釋度的樣品（測量范圍內的高、中、低濃度）
在3 個試驗中對每一個稀釋度重復測定3 份
測定不同工作日間的變化
測定不同批號的試驗材料間的變化
測定不同實驗員間的變化等等
計算每一試驗中每一濃度測定結果的均值和SD
計算試驗間每一濃度的CV 值
3）、測定限度
對于生物測定，LOD 就是產生始終如一的比空白對照強的反應的最低濃度。產
生比空白對照高2-3 個SD 的反應一般認為是滿意的測定限度。下述步驟是以免疫測
定的OD 值作為例子。
目的：確定比空白對照高3 個SD 的值
步驟：配制一份適當濃度樣品
配制一份不含樣品的空白對照液（0 濃度）
按照SOP 至少測定3 次，每次要重復2 孔
測定樣品和空白對照的OD 值
計算空白對照的SD 值
LOD=3×對照的SD 值/（樣品OD/樣品濃度）。
另外，在某些測定中采用2：1 或3：1 的信/噪比作為測定限度；若用標準誤來表
示則為3.3SD/b，其中SD 為標準誤，b 為對照樣品線性回歸的直線斜率。
測量限度采用10：1 的信/噪比；或10SD/b（12）。
4）、直線性和測定范圍
目的：測定觀測值的直線擬合度
步驟：在測量范圍內配制6-8 個稀釋度
每一稀釋度測定3 次，每次重復測定3 份
計算每次試驗的測定值、真值和回收率%
分析線性回歸并計算每次試驗的相關系數R
另一種方法：
計算每一稀釋度的準確性和精密性
測定范圍即是能夠得到滿意的準確性和精密性的最高和最低濃度。
總之，生物制品的測定由于其生物測定的變異性，因此，不同的測定方法和反應原
理時在驗證中應根據具體情況進行不同參數的測定，有時還要對樣品凍融等因素對測定
結果的影響等等。在對測定方法的驗證中主要應對方法的適用性和可靠性進行測定，以
確定該方法在本實驗室內能夠得到準確和重復的實驗結果，并且在測定范圍、測定限度
和特異性等方面達到了測定的要求，確保實驗數據的準確與可靠。