如何對新城疫開展免疫監(jiān)測

lhh1314

1 病原
新城疫（ND）是由禽副流感病毒Ⅰ型新城疫病毒（NDV）引起的一種主要侵害雞、火雞、野禽及觀賞鳥類的高度接觸傳染性、致死性疾病。NDV對雞的感染率和致死率均頗高，是最重要的一種家禽傳染病。NDV不易變異，只有一個血清型，屬于副粘病毒科副粘病毒屬的Ⅰ型副粘病毒（PMV-Ⅰ），病毒有囊膜，囊膜有兩種纖突，即血凝素和神經氨酸酶，能凝集多種動物的紅細胞。
盡管已有不少的實驗室方法可用于ND的血清學診斷，例如，病毒中和試驗、ELISA試驗、瓊脂雙擴散試驗、神經氨酸酶抑制試驗等。但迄今為止，血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（HI）仍不失為一種快速準確的傳統(tǒng)實驗室手段。
2 實驗材料
2.1 參考血清
實驗中的NDV陽性參考血清可用6~9周齡的SPF雞制造。腿部肌肉注射0.1ml具感染性的低毒力尿囊液，同時滴鼻0.1ml，兩周后重復一次，再過3周以后采血提取陽性血清。
2.2 抗原
ND-HI抗原是采用經適當稀釋的具有感染性的尿囊液，在實際工作中常用0.1%甲醛滅活的病毒液。F株已被指定為NDV的國際參考株，但通常多用LaSota株代替比較方便。根據經驗，LaSota血凝抗原HA效價以＞10log2為佳。目前青島易邦、中檢所和哈獸研均有商品化試劑出售。
2.3 1%紅細胞液
應自SPF或無抗體雞采得。采用翅靜脈或心臟采血后放入有抗凝劑的離心管中，混勻后2000r/min，5~10min，吸去上清和白細胞膜，再加稀釋液洗滌，如此反復3~4次，將最后一次離心的紅細胞泥按1%的稀釋度加入稀釋液。
3 方法
HA和HI試驗已推廣β-微量法，在96孔反應板上進行。目前，常見樣品反應量為25、30和50微升，其結果基本無差異。對所有副粘病毒的各血清型，未免疫或未被感染的禽，其HI效價通常低于1:8。大多數禽血清，高于這個水平的非特異性效價是極少見的。
4 影響結果的因素
4.1 紅細胞懸液濃度
來源于不同個體雞的紅細胞，對抗原的敏感性不盡相同。因此實驗時最好用3~4只未免疫雞。
4.2 抗原的稀釋倍數
配制抗原時，濃度必須準確。當抗原濃度高時， HI抗體效價就下降；當抗原濃度低時，HI抗體效價就上升。
4.3 實驗用的稀釋液
稀釋液的pH值對實驗有影響。稀釋液的pH值5.8以下，紅細胞容易產生自凝現(xiàn)象；pH值在7.8以上凝集圖形易消失，也會造成實驗誤差。而pH值為7.0時，紅細胞沉降最充分，圖形最清晰，HI效價也最高，因此實驗時用pH7.0~7.2的稀釋液。目前多用磷酸緩沖液（PBS）。
4.4 實驗時的溫度
實驗時的溫度，從4~37℃，隨著溫度上升，HA與HI滴度提高，但在37℃時，凝集的紅細胞易洗脫；4℃以下紅細胞易產生自凝，故操作常用20~22℃。
4.5 實驗的作用時間
一般以30~45min為宜，CP集團統(tǒng)一為30min。
4.6 其他
人為因素、操作程序因素、器具的潔凈與否等都會對檢測結果有影響。不同實驗室間對于同一批次樣品的檢測數據不宜做橫向比較，但對同一雞場樣品的檢測結果的縱向趨勢應相似。
5 檢測頻率及采樣數量
對于健康雞群可每四周檢測一次，對于發(fā)病的雞群，可采集發(fā)病后7~10天的樣品進行檢測。可以按每個舍0.6%的比例采樣，但每舍不得少于15份，常規(guī)采樣20~30份即可。
6 檢測時機
6.1 1d ：檢測母源抗體，考察種代健康情況及確定免疫時間。
6.2 肉雞：35~42日齡，測定出欄前機體抗體情況。
6.3 種雞/蛋雞：每4周一次。
6.4 免疫試驗或疫苗對比試驗：每周采血化驗。
7 采樣的具體要求
采樣應注意樣品數量與質量，既保證時間連續(xù)性，又要兼顧階段連續(xù)性。
7.1 每個雞舍應分至少五個點隨機采樣。采血的量要適當，一般在1~1.2ml左右(4/5管)為宜。如果采血量不足，可能不夠完成所有的化驗項目。
7.2 采血時采出的血液應沿著采血管管壁慢慢注入管內，切忌用力過猛起泡造成溶血。
7.3 剛采好的血要避免受冷和振動，應在25~37℃環(huán)境中加蓋靜置1~2h，這樣有利于血液凝固和析出血清。靜置后立即送檢，如不能及時送檢。須放入4℃冰箱保存（不要超過24h），切忌冰凍。
7.4 血樣運輸時盡可能直立，避免灑漏。
8 采樣方法
8.1 心臟采血（適用于剛出殼到兩周內的小雞）
一般用前胸口進針采血，具體方法：用左手固定使雞仰臥,胸骨嵴朝上，用手指將嗉囊及其內容物壓離局部,暴露出胸前口，將針頭由前胸口順著體中線水平方向刺入,直至穿進心臟。若針頭在心臟中，抽拉注射器管芯可將血液吸入,若未見血液吸入針管中，可小心地前后移動注射器和針頭,直到刺入心臟為止。切忌左右亂扎，導致小雞大出血死亡。
8.2 翅靜脈采血
固定雞后,展開翅膀在翅下選一條粗大靜脈，用碘酒和酒精消毒，以手指壓迫靜脈的回心端，使靜脈怒張，然后用注射器刺入血管，發(fā)現(xiàn)血液回流時，用注射器抽取血液。采完后拔出針頭，壓住進針處止血，再將血液沿管壁慢慢注入采血管內，靜置使血液凝固。
9 如何評價ND-HI
9.1 正常雞群
9.1.1 母源抗體半衰期為4.5天（HI），出殼后5日齡內HI滴度有所升高，然后下降。
9.1.2 商品肉雞母抗≤26，有時可達29，一般情況下母抗較種代雞低2個滴度。
9.1.3 種雞/蛋雞2個月時可達26~8 ，甚至更高，多次免疫也不會超過212。
9.1.4 通常一旦建立免疫保護，HI抗體維持2個月無大變動，抗體波動不會超過2個滴度。
9.1.5 正常情況下，油苗免疫一次可以提升1.5~2個滴度，否則就是免疫失敗，應盡快從雞群健康狀況、疫苗質量、免疫方法等多方面尋找原因，設法補救。
9.1.6 免疫雞群血清ND-HI抗體水平與保護力的關系
（ND免疫臨界值和產蛋安全免疫臨界值）

ND-HI滴度	雞群接觸到vvNDV后的情況	備注
<4Log2	死亡臨界值。50%以上的死亡率，可達100%。	免疫抗體
4-7Log2	90%以上的保護率。
>6Log2	能抵抗呼吸道感染,仍有少數雞死亡。
8Log2	100%保護，但產蛋雞群產蛋下降。
9-10Log2	產蛋安全臨界值。
11-13Log2	NDV仍可在雞體內復制。
>13Log2	不再出現(xiàn)NDV復制（不發(fā)生感染）	強毒感染后的抗體

9.2 發(fā)病雞群
9.2.1 發(fā)病后2w的ND-HI至少比發(fā)病前高2個滴度，個別可能異常高。
9.2.2 肉雞或育雛的種雞/蛋雞發(fā)病后10d，ND-HI可上升5個滴度到210 。
9.2.3 種雞/蛋雞場野毒感染1個月后，個別的滴度可達214或更高。
9.2.4 生物安全措施良好的雞場往往存在野毒的滾動感染，因此雞場的病程往往持續(xù)數月之久。如確診的早，可從遠離發(fā)病舍的（假定）健康雞舍做緊急免疫。

需要認識到，常規(guī)血清學檢測的結果僅代表雞群的體液抗體（循環(huán)抗體IgG）水平，而ND活苗免疫后產生局部免疫力的分泌型抗體IgA和IgM不能被常規(guī)方法檢測出來。因此用HI結果來評價其抗體水平的高低有一定的局限性。另外，HI抗體雖然與病毒的中和抗體呈正相關，但不能等同。尤其是生產后期，雞群HI滴度有時偏低，但對NDV的實際抵抗力往往尚高。相反地，有時HI效價很高，卻仍然會發(fā)生NDV感染。因此，緊密結合雞群的臨床情況來分析檢測結果才能幫助我們做出正確判斷并及時發(fā)現(xiàn)和解決生產中的問題。