飼用芽孢乳酸菌的生物學特性研究

華牧偉業

　　[摘要]試驗研究了芽孢乳酸菌的生長特性、泌酸能力、高溫耐受性、耐酸性、膽鹽耐受性和抑菌能力，旨在為微生態飼料添加劑的研發提供試驗依據。結果表明，芽孢乳酸菌在30 h時菌體質量濃度達到最高值，在32 h時產酸量最高，最后在pH 3.80左右趨于穩定；芽孢乳酸菌經90℃處理10 min后存活率達到73.47%，pH 2.0及1.0%膽鹽處理3 h后存活率分別為54.69%、24.36%；芽孢乳酸菌對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均具有較好的抑菌性能，抑菌圈直徑分別為18.38、19.76、17.42 mm。結果說明，芽孢乳酸菌具備良好的生物學特性，是一株優異的益生菌株。

　　[關鍵詞]芽孢乳酸菌；生物學特性；耐受性；微生態添加劑

　　[中圖分類號]S816.32[文獻標識碼]A[文章編號]1004-3314（2012）16-0024-03

　　微生態飼用添加劑具有良好的生物學活性，能調節動物胃腸道微生物菌群的平衡，促進動物消化吸收、生長發育，提高飼料轉化率和生產性能，增強動物免疫力，以及具有改善飼養環境和減少環境污染的獨特作用（Gomze等，2007；王旭明等，2002）。芽孢乳酸菌因其同時具有乳酸菌和芽孢桿菌的優點而成為為理想的益生菌之一（相菲和徐厚春，2009）。本試驗對飼用芽孢乳酸菌的生物學特性進行研究，以期為微生態飼料添加劑的研發提供試驗依據。

　　1·材料與方法

　　1.1試驗材料

　　1.1.1試驗菌株 試驗益生菌：芽孢乳酸菌，由武漢泛華生物技術有限公司提供；試驗致病菌：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，由華中農業大學國家農業微生物重點實驗室提供。

　　1.1.2培養基

　　普通瓊脂培養基：酵母浸出物3 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，葡萄糖15 g，瓊脂15 g，調整pH 7.2，定容至1000 mL。普通液體培養基：普通瓊脂培養基中不加瓊脂。

　　1.1.3主要試劑

　　PBS緩沖液，用于菌液的稀釋。

　　1.1.4主要器材

　　電子天平（沈陽龍騰電子有限公司），酸度計（成都方舟科技開發公司），UV-1200 spectrophoto meter（美譜達儀器公司），立式超低溫保溫箱（海爾公司）。

　　1.2試驗方法rK

　　1.2.1芽孢乳酸菌的復蘇

　　將-20℃保存的菌株按1%的接種量接種于普通液體培養基中，在37℃和165 r/min條件下培養10~12 h，待渾濁后進行后續試驗。

　　1.2.2生長曲線測定將復蘇后菌液按5%的接種量接種于普通液體培養基中，在37℃和165 r/min條件下培養，以普通液體培養基作校正，測定不同時間段培養液的OD600值，前24 h每1 h一測，后36 h每2 h一測。

　　1.2.3產酸能力測定

　　將復蘇后菌液按5%的接種量接種于普通液體培養基中，在37℃和165 r/min條件下培養，測定不同時間段培養液的pH（郭志杰等，2010）。

　　1.2.4高溫耐受性試驗

　　將復蘇后菌液按1%的接種量接種于PBS緩沖液中，分別置于60、70、80、90℃的水浴鍋中處理10 min，分別于處理前和處理后進行平板涂布，計算存活率（范俊娟，2009）。

　　1.2.5耐酸性試驗

　　用鹽酸調節PBS緩沖液的pH分別為2.0、2.5、3.0、4.0，121℃高壓滅菌后備用。將復蘇菌液按1%的接種量接種于上述pH梯度稀釋液中，37℃作用3 h，渦旋混勻，涂布平板進行活菌計數，以0 h計數為對照，計算存活率（劉文華等，2008）。

　　1.2.6耐膽鹽試驗

　　用PBS緩沖液配制濃度分別為0.2%、0.5%、0.8%、1.0%的豬膽鹽溶液，高壓滅菌后備用。按1%的接種量將復蘇菌液接種于上述不同濃度的豬膽鹽溶液中，37℃作用3 h后，涂布平板進行活菌計數，以處理前細菌數為對照，計算存活率（趙瑞香等，2004）。

　　1.2.7抑菌性試驗

　　將致病菌分別培養12~24 h，按20倍稀釋，取100μL致病菌液均勻涂布到事先準備好的無菌瓊脂平板上。采用牛津杯法，每個試驗設3個重復，37℃培養12~24 h，測定抑菌圈直徑，以無菌普通液體培養基作對照（郭志杰等，2010）。

　　2·結果

　　2.1芽孢乳酸菌的生長曲線測定結果

　　由圖1可知，芽孢乳酸菌未經過遲緩期，直接進入對數期生長，0~6 h生長速度最快，6~18 h生長速率減緩，18~26 h生長速率有所提高，26~34 h生物量變化不明顯，達到穩定期，34 h生物量開始降低，進入衰亡期。

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　　2.2芽孢乳酸菌的產酸能力測定結果

　　由圖2可知，0~10 h芽孢乳酸菌產酸能力非常強，培養液的pH迅速降低，10~12 h培養液pH有短暫的回升，然后又繼續降低，32 h pH為3.60，此時pH降到最低。之后pH逐漸升高，最后pH在3.80左右趨于穩定。

　　2.3芽孢乳酸菌的高溫耐受性試驗結果

　　由圖3可知，對芽孢乳酸菌進行高溫處理后發現，芽孢乳酸菌在60℃處理10 min后存活率達94.37%，90℃處理10 min后存活率高達70%以上，說明芽孢乳酸菌對高溫有較好的耐受性。






2.4芽孢乳酸菌的耐酸性試驗結果

益生菌要到達腸道發揮作用，必須經過胃酸的作用，因此其必須具有良好的耐酸能力，才能到達腸道發揮功能。由圖4可知，對該芽孢乳酸菌進行酸處理后發現，芽孢乳酸菌在pH 2.0環境中存活率高達54.69%，說明芽孢乳酸菌具有較好的耐酸特性。



　　2.5芽孢乳酸菌的耐膽鹽試驗結果

　　益生菌到達十二指腸時要受到膽鹽的抑制作用，因此必須有較高的膽鹽耐受性，才能發揮益生特性。由圖5可知，對該芽孢乳酸菌進行膽鹽處理后發現，芽孢乳酸菌在0.2%豬膽鹽溶液中存活率在90%以上，在1.0%的豬膽鹽溶液中存活率超過20%，說明芽孢乳酸菌具有較強的耐膽鹽特性。

3·結論

　　益生菌通過添加到飼料進入胃腸道，在胃腸道中定殖，并能通過大量繁殖的有益菌發揮其益生作用。研究表明，理想的益生菌應具有生長速度快、對胃腸道環境（胃酸、膽鹽等）耐受能力強，具有一定的抑菌能力等特點（Geimonde和Salminen，2006）。Hyronymus等（2000）研究報道，芽孢乳酸桿菌、左旋乳酸芽孢桿菌、消旋乳酸芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌在pH 2.0中生長受到強烈的抑制。Guo等（2006）研究發現，中低質量分數膽鹽（≤0.3%）對芽孢桿菌的存活影響很小；而高質量分數的膽鹽（>0.3%）對不同來源菌株的耐受能力就表現出明顯的差異（王煥等，2008）。芽孢桿菌的抑菌作用，不同菌株各有不同。王德培等（2010）對分離到的1株枯草芽孢桿菌的抑菌譜進行了研究，結果表明，該枯草芽孢桿菌具有廣譜抗真菌活性。陳家祥等（2010）研究報道，加地衣芽孢桿菌有益于肉雞的腸道發育，能夠抑制盲腸內有害菌的生長。

　　本試驗表明，此株芽孢乳酸菌具有較好的生長性能和產酸能力，在24 h之后會逐步進入穩定期，最終pH值會達到3.80左右，這有利于在消化道內定植后快速生長及維持消化道的酸性環境。此外，芽孢乳酸菌具有優良的生物學特性，可耐受90℃高溫，有利于微生態添加劑的生產；能耐受pH 2.0的酸性環境，存活率達到50%以上，使芽孢乳酸菌能順利通過胃內酸性環境到達腸道發揮生物學功能；對豬膽鹽溶液也有較高的耐受性，在發揮功能的同時免受豬膽汁酸的抑制作用。從整體水平可以看出，此株芽孢乳酸菌具有較好的生物學功能，可以作為微生態飼料添加劑生產使用。

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