微生態制劑對黃曲霉真菌的生長抑制和拮抗研究

中科2013

微生態制劑對黃曲霉真菌的生長抑制和拮抗研究

                                 

【摘要】：黃曲霉及其毒素危害巨大，是飼料食品中的主要污染源之一。乳酸菌作為益生菌，在食品防霉去毒的方法已獲得應用，這是運用生物控制的一個成功范例；芽孢桿菌也已經可以從海洋生物中提取并應用于抑制黃曲霉真菌的生長；黑曲霉因為具有良好的分泌多種降解酶的能力，并且生產的酶制劑、有安全、可靠、不產生毒素的特點，是公認安全(GRAS)的微生物，也是科技工作者用生物控制方法來降解黃曲霉毒素的一種有效微生物。

【關鍵詞】：微生態、中藥、益生素、發酵、黃曲霉真菌 乳酸菌 芽孢桿菌 黑曲霉 生長抑制

霉菌毒素污染造成全世界每年糧食的損失達數千億美元，而黃曲霉毒素因其對人、畜肝臟的劇烈損害而名列毒性之首，被列為極毒。黃曲霉菌( Aspergillus flavus) 產生的黃曲霉毒素( aflatoxin)是目前發現的毒性和致癌性最強的化學物質之一，被世界衛生組織認定為1A 級危險物( WHO，1993)。黃曲霉毒素( AFT) 主要是糧油食品上常出現的黃曲霉( Aspergilluflavas Link ) 和寄生曲( Aspergillus ParasiticasSpeave) 產生的種具活性的、有毒的次級代謝產物。黃曲霉可通過產生孢子進行傳播，侵染植物、植物產品各種食品和飼料等。它對農作物的產量，人、獸和禽類的健康構成很大威脅。凡是含淀粉多的食品，如玉米、花生、大豆、大米、小麥、面粉等最易受到黃曲霉及其毒素的污染，果仁類也常受污染。因此采取何種措施來預防黃曲霉的生長與產毒是根本措施。目前的防霉措施是利用良好的農業生產工藝從田間防霉，在收獲與保藏中采取防霉措施，此方法涉及多個步驟，操作起來較困難。此外，也有用化學防霉劑，多為化學合成物質，人們對其長期應用的安全性尚存疑慮。因此，對黃曲霉及其毒素的生物防治，目前國內外的研究方向主要是利用植物提取物和微生物的次生代謝產物來獲得具有抗菌或降解毒素特性的物質。研究發現，多種植物提取物，如山蒼子精油、百里香油、海馬齒香精油、玫瑰精油等對黃曲霉生長以及毒素的產生有較強抑制作用。目前發現能有效防治黃曲霉的微生物主要有乳酸菌、芽孢桿菌以及黑曲霉等。

1、 乳酸菌對黃曲霉真菌的生長抑制作用

    從健康動物體內分離抗黃曲霉活性的乳酸桿菌， 不僅能添加在飼料中， 起到生物防霉的作用， 并且能在動物體內定植， 為進一步研究開發飼料生物防霉劑提供菌種資源。

    黑龍江省微生物研究所研究人員做了乳酸桿菌對黃曲霉真菌的生長抑制作用的研究實驗。

1.1 對抑制霉菌生長試驗：分別用乳酸桿菌的全菌液或離心上清液( 3000 r/min， 20 min) 1 mL 涂布PDA 培養基， 待液體完全吸收后， 在培養基的中心接種20 μL 黃曲霉孢子懸液( 1×10^7 cfu/mL) ，同時設未涂布乳酸桿菌的空白PDA 培養基為對照組， 接種20 μL 黃曲霉孢子懸液， 28 ℃培養4d，分別測量菌落大小， 計算乳酸桿菌對霉菌生長的抑制率。霉菌生長的抑制率(%) =( 對照組菌落直徑- 試驗組菌落直徑) /對照組菌落直徑×100。每個處理設3 個重復組， 各試驗重復3 次， 以3 次試驗結果平均值進行分析。

1.2 對黃曲霉孢子萌發影響試驗： 設2 個處理組和2 個對照組。處理1： 將1 mL 乳酸桿菌培養液( 1×10^9 cfu/mL) 和50μL 黃曲霉孢子懸液( 1×10^5 cfu/mL) 同時接種到5mL 新鮮MRS 液體培養基中。處理2: 將0.5 mL黃曲霉孢子懸液( 1×10^5 cfu/mL) 加入到5 mL 乳酸桿菌培養液中( 1×10^9 cfu/mL) 。對照組1: 用乳酸調MRS 肉湯與乳酸桿菌培養液pH 相同， 然后將500 μL 和50 μL 黃曲霉孢子懸液分別接種到調好pH 值的MRS 肉湯中， 作兩種不同濃度孢子懸液的對照組。對照組2: 將500 μL 和50 μL 黃曲霉孢子懸液分別接種到空白的MRS 肉湯中， 不調pH 值。2 個處理組和2 個對照組均在28 ℃培養， 分別于第6、18、24 h 取不同處理組0.1 mL 涂布PDA 平板， 28 ℃培養5 d， 進行孢子計數。以孢子未萌發或萌發數量顯著減少判斷為乳酸桿菌對其有抑制作用。設對照組2 的生長率為100 %， 計算處理組和對照組1 的抑制率， 計算公式如下:

抑制率(%) =[對照組2 孢子萌發數- ( 處理組或對照組1 孢子萌發數) /對照組2 孢子萌發數]×100。

1.3 霉菌生長抑制試驗結果：本試驗中， 雞源乳酸桿菌B30 以及牛源乳酸桿菌BN3 是對黃曲霉菌生長有明顯抑制作用的乳酸桿菌。由表1 可見，與對照組相比， BN3 和B30 在培養48 h 后， 除BN3 上清液抑菌效果不佳外， 其他數據均顯示出對黃曲霉的生長有較明顯的抑制效果， 并且隨著培養時間的增加， 霉菌生長速度同樣受到抑制， 而其余乳酸桿菌的抑菌現象均不明顯。另外， 乳酸桿菌的全菌液與離心上清液相比而言， 全菌液的抑菌效果優于上清液。

          表1乳酸桿菌全菌液和離心上清液對黃曲霉生長的抑制作用

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                                             注：NR表示無結果。

1.4 乳酸桿菌對孢子萌發影響試驗結果：結果見表2。從表2 可以看出， 乳酸桿菌BN3 和B30對孢子的萌發均起到了抑制的作用，并且在孢子與乳酸桿菌共同培養6 h 就出現了抑菌現象。與MRS 空白對照組相比， 用乳酸調整pH 值后， 乳酸所形成的低pH 環境同樣會作用于孢子， 使其萌發受到影響。然而其抑制作用仍不如乳酸桿菌對霉菌孢子的抑制作用。乳酸對照組對孢子萌發的抑制作用隨時間的增加呈拋物線分布， 在18 h 的抑制作用高于6 h 和24 h。處理組1 與處理組2相比， 處理組2 的抑菌效果更好， 即抑制孢子萌發率更明顯。

表2 乳酸桿菌BN3 和B30對黃曲霉孢子萌發的抑制作用

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注: G1 為處理組1， G2 為處理組2; CK1 為對照組1。

1.5 結果分析：

1.5.1 在對黃曲霉生長抑制試驗中：發現乳酸桿菌全菌液的抑制效果比乳酸桿菌上清液更好。其原因可能是，除乳酸桿菌全菌液中本身含乳酸和一些抑菌代謝產物形成抑菌現象外， 乳酸桿菌細胞在被接種到PDA 培養基中后與霉菌間產生了多因素拮抗作用，故比乳酸桿菌離心上清液的抑霉菌效果好。

1.5.2 乳酸桿菌對孢子萌發影響試驗結果顯示：處理組1 與處理組2 相比， 處理組2 的抑菌效果更好， 其原因可能是接種孢子時乳酸菌全菌液濃度較處理組1 高出近4 倍， 在最初的一段時間內就達到了抑制霉菌孢子萌發的作用。另外， 乳酸桿菌代謝過程中會產生大量的乳酸， 使環境中的pH值降低， 抑制黃曲霉生長。乳酸所形成的低pH 環境有降低黃曲霉孢子萌發率的作用， 但接種了乳酸桿菌的處理組表現出更明顯的抑制作用。這說明，對黃曲霉孢子萌發抑制作用的產生不僅在于低pH 環境的影響， 還有乳酸桿菌代謝產物和微生物間互相拮抗等多因素同作用的結果。

2、芽孢桿菌抑制黃曲霉生長

2.1 試驗方法：采用濾紙片擴散法從海洋中分離篩選出1 株抑制黃曲霉活性高的微生物，利用16SrDNA 特異性擴增技術對其菌種進行鑒定, 并研究其對黃曲霉菌絲延長、孢子萌發和毒素合成的影響，用Beaco n黃曲霉毒素檢測試劑盒測定黃曲霉毒素含量。

2.2 試驗結果： 該菌株為一株海洋巨大芽孢桿菌( Bacillusmegater ium) ，其菌體對黃曲霉菌絲延長、孢子萌發和黃曲霉毒素生物合成都有明顯地抑制作用， 1× 109CFU· mL- 1菌體對黃曲霉孢子萌發的抑制率達87%， 1× 108 CFU· mL- 1 菌體對黃曲霉毒素合成的抑制率可達50. 75%。初步認為其抑制機制是該海洋巨大芽孢桿菌可產生某種次級代謝產物來抑制黃曲霉孢子萌發和菌絲延長。

               表3 巨大芽孢桿菌對黃曲霉孢子萌發的抑制作用

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注: * 同列數據后的不同小寫字母表示在P< 0. 05 水平差異顯著； n= 3，數據用平均值% SD 表示。

    從表3中可以看出,巨大芽孢桿菌能極顯著地抑制黃曲霉產黃曲霉毒素﹙P＜0.01﹚抑制50.75% . 越來越多的研究表明, 黃曲霉的次級代謝產物( 包括黃曲霉毒素對黃曲霉的生長非常重要, 其中, 黃曲霉毒素的合成與黃曲霉孢子形成有密切聯系, 抑制黃曲霉毒素的產生, 往往也會抑制黃曲霉孢子的形成 ；因此， 認為該株海洋巨大芽孢桿菌通過抑制黃曲霉毒素等次級代謝產物的合成來抑制黃曲霉的生長；同時這種抑制的產生是因為該株海洋巨大芽孢桿菌會抑制黃曲霉次級代謝產物調節基因和黃曲霉毒素合成基因的表達。如L aeA、af lR 和af lS 等。

3、 黑曲霉對黃曲霉生長的抑制

3.1 試驗方法：采用90 × 2.6 × 1013N+/cm2 注入黑曲霉篩選能抗黃曲霉(Aflavus)生長的突變菌株，以利發酵中控制被黃曲霉污染的原材料的再污染。進行產毒黃曲霉與被離子注入的黑曲霉混合對峙、原黑曲霉菌株與黃曲霉單獨培養生長及混合對峙培養實驗。

3.2 試驗結果：經離子注入的菌株及未注入菌株均對黃曲霉產生抑制作用，但后者僅有微弱抑制，前者不僅表現出幾乎不能使黃曲霉生長，且已長出的黃曲霉菌絲體較瘦小，并呈灰白色。從培養基中提取物檢驗結果顯示，黃曲霉組表現出有較明顯的熒光反應，而黑曲霉菌株對峙培養物提取物中有微弱的熒光反應，其黑曲霉突變株對峙培養物未見熒光反應檢出。這表明黑曲霉原菌株雖然能對黃曲霉只有微弱抑制，但表現出黃曲霉產毒和合成色素能力降。與對照組相比，突變株有較強抑制黃曲霉生長能力。

4、結語：乳酸菌、芽孢桿菌以及黑曲霉些微生物對黃曲霉真菌的生長都有著各自的抑制作用，并且這些抑制作用也是相當不錯的，學者們做進一步的探索以減少黃曲霉素生長和黃曲霉毒素對人類身體的危害是勢在必行的。

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