飼料用木聚糖酶活力測定的研究

kiroco

飼料用木聚糖酶的分析測定是長期以來困擾木聚糖酶生產(chǎn)和應(yīng)用的一個主要難題,特別是固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的木聚糖酶,發(fā)酵成品中往往含有其它非淀粉多糖酶(纖維素酶、葡聚糖酶、果膠酶和甘露聚糖酶等)[1-3]。文獻報道的關(guān)于影響酶活測定的因素很多,測定的重復(fù)性較差 [4-5，7]，除了溫度和pH值以外,還存在著其它很多不確定的因素。本文將從底物的性質(zhì)和濃度、酶樣的稀釋度、離子強度和反應(yīng)時間等方面討論對酶活測定的影響,提出比較可行的飼料用木聚糖酶的分析方法。

酶活定義為在37 ℃和設(shè)定pH值條件下，每分鐘內(nèi)從底物溶液中降解釋放1 μmol/l還原糖所需要的酶量為一個酶活單位(U)。測定木聚糖酶活力的方法主要有3種：粘度法、底物染色法和還原糖法。

粘度法是通過測定木聚糖酶對底物粘度的降解速度來計算酶活力，這種測定分析方法有較好的實用價值，但是測定過程比較繁瑣，而且重復(fù)性較差，目前很少采用。

底物染色法是一種比較簡便快速的測定方法,其基本原理是以木聚糖為基質(zhì),用膠聯(lián)方式連接和包裹特定的染料，制成染料含量均衡,質(zhì)量穩(wěn)定的片劑。這種片劑容易溶于水溶液中,與木聚糖酶反應(yīng)后,長鏈的木聚糖被降解,結(jié)合的染料分子被釋放到溶液中。通過測定溶液中染料的濃度,就可以就算出酶活力。這種測定方法經(jīng)常被一些專業(yè)生產(chǎn)生物酶的大型企業(yè)采用。但是它只能測定特定的木聚糖酶活力,不具有代表性。

還原糖法是通過測定還原糖的產(chǎn)量來計算酶活力。這種分析方法也比較簡便，而且重復(fù)性也比較好。國內(nèi)外關(guān)于木聚糖酶的研究報告多數(shù)采用這種方法。這種方法的主要不足是不能很好地分析內(nèi)切酶的活力，而內(nèi)切酶的活力對于飼料酶的實際使用效果來說是很重要的。

如果希望通過測定木聚糖酶在某一標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的活力來判斷木聚糖酶質(zhì)量的優(yōu)劣或者預(yù)測其動物飼喂效果是遠遠不夠的。木聚糖酶的實際作用底物是不溶于水的高聚物，它們主要存在于植物種子的表皮層內(nèi)，與葡聚糖、果膠、甘露聚糖、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合在一起。在天然木聚糖與水組成的多相體系中，酶總是處于底物不飽和狀態(tài)，因此難以用測定酶反應(yīng)初速度的方法測定酶活力。酶與底物的反應(yīng)是在固相界面上進行的，其酶解反應(yīng)速率受到底物對酶蛋白吸附速率和產(chǎn)物擴散速率的限制[4]。目前通常采用的底物是溶于水的木聚糖，如燕麥木聚糖和樺木木聚糖，其測定值要比實際發(fā)揮作用的酶活力高出很多倍[5-6]。從目前的研究進展分析，制定一個絕對公平的標(biāo)準(zhǔn)是很困難的，幾乎是不可能的。

2005年6月，我們接受全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會下達的木聚糖酶活力測定的標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)，聯(lián)合了眾多酶制劑企業(yè)共同起草了木聚糖酶活力測定的標(biāo)準(zhǔn)。在標(biāo)準(zhǔn)起草過程中，我們分析了近300 個含有木聚糖酶的樣品，測定數(shù)據(jù)約1 200個。通過綜合各種因素，采用還原糖法，分析了影響酶活力測定值的因素，同時結(jié)合生產(chǎn)實際，制定了相對比較公正科學(xué)的評判標(biāo)準(zhǔn)。

1 重要操作分析參數(shù)的確定

1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍

確定酶解產(chǎn)物濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍是酶活力測定的前提，試驗采用DNS法測定木糖濃度，其線性范圍為：木糖濃度在0.2～0.7 mg/ml之間，吸光度在0.15～0.70之間

1.2 底物的性質(zhì)

從酶的組成分析可以發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶存在著底物作用的特異性。

目前工業(yè)生產(chǎn)中使用的木聚糖酶主要有兩大類，一類是用于飼料，另外一類是用于造紙。用于飼料的木聚糖酶應(yīng)該以降解燕麥木聚糖的能力為主要檢測指標(biāo)，而用于造紙工業(yè)的木聚糖酶應(yīng)該以降解樺木木聚糖為主要分析指標(biāo)。

在實際使用過程中，單純比較某一種酶活力指標(biāo)是不夠的，但是要想全面衡量飼用木聚糖酶的活性和使用效果也是很困難的。目前國內(nèi)外的研究報道通常以降解燕麥木聚糖(Sigma X0627)的活力作為主要比較指標(biāo)[8-10]，這是因為測定降解燕麥木聚糖相對比較容易，重復(fù)性也比較好。因此筆者建議測定飼料用木聚糖酶活力的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)也以測定降解燕麥木聚糖的活力為主要指標(biāo)。

從理論上分析，只要滿足3個條件，即能被酶作用、很好的代表性、很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，都可以作為測定飼料酶活力的底物。但是，從目前的研究分析發(fā)現(xiàn)，能符合這個條件的底物只有Sigma X0627，雖然Sigma X0627這個產(chǎn)品的本意并不是想用于木聚糖酶活力測定的標(biāo)準(zhǔn)底物。無論是國內(nèi)還是國外，也不論是生產(chǎn)實際還是SCI論文，涉及木聚糖酶活力測定的底物基本上都是用Sigma X0627。

1.3 底物濃度對測定活力的影響

底物濃度對測定值有重要影響，這主要與酶反應(yīng)的米氏常數(shù)Km值有關(guān)。圖2是關(guān)于3種菌種產(chǎn)生的木聚糖酶，它們要求的飽和底物作用濃度(使酶活發(fā)揮達到99%的飽和活力時的底物濃度)有一定差異。

從理論上分析，底物濃度越高分析的偏差越小。但是，實際上并非如此，過高的底物濃度也會對測定結(jié)果產(chǎn)生不利的影響。燕麥木聚糖比較難溶于水，需要先在堿性條件下加熱，然后才能溶解。如果配制濃度過高，底物溶液中的還原糖和低聚糖含量都增大，使測定本底值升高，所以過高的木聚糖濃度是不必要的。由圖2可知，三種木聚糖酶(Xylanase 1、Xylanase 2、Xylanase 3分別來源于硫色曲霉A. sulphureus、米曲霉A. orzyae和黑曲霉A. niger)，它們的飽和底物濃度都不超過3.0 mg/ml。

目前市場上流行的由畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶，其結(jié)構(gòu)基因也是來自曲霉菌或者細菌，而細菌產(chǎn)生的木聚糖酶(包括其它酶種)其飽和底物濃度遠低于曲霉菌產(chǎn)生的酶。

燕麥木聚糖(Sigma X0627)在中性條件下很難溶解，在堿性條件下容易溶解。在溶解燕麥木聚糖底物時可以先在氫氧化鈉堿性溶液中溶解，然后再用醋酸溶液調(diào)節(jié)到所需的酸堿度。事實證明，這種方式是比較好的，所產(chǎn)生的本底還原糖濃度也是很低的，對測定結(jié)果影響很小。

1.4 反應(yīng)液離子強度對測定的影響

反應(yīng)液的離子強度對酶活力測定結(jié)果也有影響。如圖3所示：在不同離子強度條件下測定纖維素酶的活力，結(jié)果有較大差異。溶液的離子強度影響酶分子的空間構(gòu)像，從而影響了酶分子活力的發(fā)揮。所以，在測定過程中應(yīng)該統(tǒng)一反應(yīng)液的離子強度，這一點往往被人們忽視。那么究竟應(yīng)該選擇何種離子強度比較合適，目前還沒有統(tǒng)一。不同的酶系要求的最佳離子強度各不相同，需要經(jīng)過探索才能確定。根據(jù)畜禽消化道的生理狀況，筆者建議反應(yīng)液的離子強度采用0.1 mol/l。

1.5 反應(yīng)時間的選擇

為了使獲得的測定值盡可能準(zhǔn)確，不僅需要選擇在線性的反應(yīng)范圍內(nèi)，而且應(yīng)該有足夠的線性反應(yīng)時間。在線性反應(yīng)條件下，延續(xù)的作用時間越長，測定的相對誤差也越小。

大量研究發(fā)現(xiàn),不同的酶系其線性作用時間各不相同。一般情況下,酶系較全的組分線性作用時間較長。而酶系比較簡單的組分,線性作用時間較短。圖4是2種比較典型的木聚糖酶系及比利時生產(chǎn)酶C 的線性范圍。硫色曲霉(A. sulphureus MAFIC-001)產(chǎn)生的木聚糖酶A的線性作用時間接近100 min，黑曲霉(A. niger MAFIC-005)產(chǎn)生的木聚糖酶B的線性作用時間不到60 min。從文獻報道的數(shù)據(jù)和筆者的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，比利時生產(chǎn)的一種由細菌發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶C的線性作用時間最長，可達8 h左右。線性反應(yīng)時間最短的商業(yè)木聚糖酶是由一種木霉發(fā)酵產(chǎn)生的，線性反應(yīng)時間不到20 min[5]。

酶反應(yīng)的線性作用時間長，對分析產(chǎn)物本底值含量高的酶產(chǎn)品是很有利用價值的。在實際測定過程中，為了消除產(chǎn)品的產(chǎn)物本底誤差，必須適當(dāng)加大稀釋度。此時就要盡量延長酶反應(yīng)時間，使形成的產(chǎn)物量盡可能與本底值拉開距離。這種情況特別適用于測定活力比較低的酶產(chǎn)品。

1.6 酶反應(yīng)液pH值的選擇

反應(yīng)液pH值的選擇是重要參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn),目前木聚糖酶的同功酶至少有200種,有商業(yè)生產(chǎn)價值的不少于10種。它們的最適pH值都不一樣,而且有些變動幅度還很大(見圖5)。

如何確定合理的分析用pH值對酶活力測定的影響。目前國內(nèi)的很多飼料生產(chǎn)企業(yè)對于飼料酶的綜合評價能力很低，很多用戶只看標(biāo)示酶活力，沒有考慮實際作用效果。由于飼料酶產(chǎn)品標(biāo)簽上不能標(biāo)示很寬泛的pH值范圍內(nèi)的表現(xiàn)酶活，另外，也由于生產(chǎn)菌種不同，即使是同樣的測定酶活力，實際使用效果也是不同的。

所以必須要定一個比較合理的pH值，在這個pH值條件下測定酶活力。酶活力只是一個酶活效果的參考值，但是對于產(chǎn)品本身來說確是判定產(chǎn)品質(zhì)量是否合格的重要指標(biāo)。

考慮到目前流行的測定木聚糖酶pH值和實際可操作性，本標(biāo)準(zhǔn)采用 5.50作為測定用pH值。

1.7 樣品酶活力檢測限量的確定

如果從純粹的分析儀器和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍考慮，樣品酶活力的檢測限量可以達到1.0 U/g，甚至更低。但試驗發(fā)現(xiàn)，一些在預(yù)混料中的飼料酶，有些木聚糖酶活力在5.0 U/g以上，也很難測定出來，往往只顯示0.2～0.5 U/g。使用螯合物以消除金屬離子的干擾，結(jié)果也不理想。這種現(xiàn)象不僅存在于木聚糖酶，其它一些飼料酶，如常用的植酸酶、纖維素酶和葡聚糖酶等都有類似現(xiàn)象。

考慮到飼料用木聚糖酶的實際情況，我們選定10.0 U/g作為其檢測限量。事實上，目前流通的絕大多數(shù)飼料用木聚糖酶(包括含木聚糖酶的復(fù)合酶)的活力很少低于20.0 U/g，選用10.0 U/g作為檢測限量已經(jīng)覆蓋了99%以上的流通產(chǎn)品。

1.8 酶樣的稀釋度對酶活力測定的影響(見表2)

酶分子的濃度對測定結(jié)果也有重要影響，表2是關(guān)于硫色曲霉固態(tài)發(fā)酵制品中的木聚糖酶活力測定值(Sigma X0627為底物)與稀釋倍數(shù)的關(guān)系。

確定酶樣的稀釋度實質(zhì)上是選擇酶分子的數(shù)量與底物分子的數(shù)量之間的比例，二者的比例只有在一定的范圍內(nèi)，酶分子的活力才能得到充分發(fā)揮。超出了這個比例范圍，酶的活力發(fā)揮受到影響。所以在測定酶活力時需要做酶樣的稀釋梯度，梯度的間隔不能太大，最好是加倍稀釋，以確定合適的線性測量范圍。

1.9 底物存放時間對酶活力測定值的影響

木聚糖酶的反應(yīng)底物(燕麥木聚糖Sigma X0627)是多聚物，長時間存放會使底物分解，產(chǎn)生較多的小分子寡聚物和單體，使測定值偏高，同時還會造成較高的本底值，影響測定精度。我們通過試驗分析了10.0 mg/ml的木聚糖底物溶液在4 ℃條件下的存放時間對本底還原糖濃度的影響，結(jié)果見表3。

木聚糖是比較容易降解的多糖。在4 ℃冰箱存放2 d，降解產(chǎn)生的還原糖達到0.142 mg/ml，這個本底值對酶活力測定結(jié)果有很大影響。建議底物配制后的存放時間不超過12 h，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.10 關(guān)于樣品處理的一些細節(jié)問題

目前在測定分析中主要存在的操作細節(jié)問題有：樣品在緩沖液中合適的存放時間和酶液如果采用過濾獲得清液是否可行。

根據(jù)我們的研究，一般情況下，樣品中的酶蛋白在磁力攪拌30 min的條件下已經(jīng)充分溶解到緩沖液中了，沒必要再進一步存放浸泡。但是如果遇到一些包裹很致密的顆粒，需要一定時間的浸泡才能使酶蛋白充分釋放?？紤]到生產(chǎn)企業(yè)的實際可操作性和分析結(jié)果的可靠性，我們建議在冰箱中再存放1～2 h。從目前我們獲得的試驗數(shù)據(jù)分析，浸泡2 h已經(jīng)足夠，目前還沒有遇到例外。

樣品酶液都采用低速離心(3 000 g以下)獲得清液，如果采用過濾，酶蛋白容易被過濾介質(zhì)吸附，從而造成酶活力損失。酶蛋白的分子量越大，截流損失越多。試驗發(fā)現(xiàn)，纖維素酶的截留損失在 10%~15%，木聚糖酶的活力損失小一些，不超過10%，考慮到離心比較方便，不會對生產(chǎn)企業(yè)帶來多大設(shè)備投資，所以，建議采用低速離心獲得上清酶液。

1.11 驗證對比

對于飼料用木聚糖酶活力的分析測定，筆者建議以Sigma X0627為標(biāo)準(zhǔn)底物，反應(yīng)液中底物的濃度為5 mg/ml，配制的木聚糖底物溶液的存放時間不超過12 h(4 ℃存放)，反應(yīng)體系的pH值為5.5，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)體系的緩沖液(HAc-NaAc體系)鹽濃度為0.1 mol/l，反應(yīng)時間為30 min。

以上述方法為基準(zhǔn)，試驗測定分析了近300 個含有木聚糖酶的樣品，現(xiàn)列舉12個比較有代表性分析結(jié)果(見表4，保留4位有效數(shù)字)，相對誤差均不超過6.0%。

2 結(jié)論

綜合上述分析結(jié)果，除了pH值和溫度以外，底物的性質(zhì)和濃度、酶分子濃度、反應(yīng)時間、溶液的離子強度和體系的運動狀態(tài)都能影響酶的測定活力。由于這些影響因素的存在，使得酶活力的測定分析變得紛繁復(fù)雜，同一種酶在不同的條件下分析獲得的結(jié)果存在很大偏差。

為了測定的統(tǒng)一，同時使結(jié)果有較好的可比性，建議固定反應(yīng)體系(即固定反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時間、底物濃度和要求的產(chǎn)物濃度范圍)。樣品酶做不同的稀釋度，只有在規(guī)定條件下產(chǎn)生所要求的產(chǎn)物濃度范圍的稀釋酶液才是有效的作用酶液，然后，以此為依據(jù)計算酶活力。這種方法雖然比較繁瑣，但是它排除了許多干擾，有較好的可比性。

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陸文清，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心，副研究員，100193，北京海淀區(qū)圓明園西路2號。

何麗花、曹云鶴，單位及通訊地址同第一作者。