第十四屆飼料商業(yè)配方師研習(xí)班問題集錦（一）

畜牧編輯

　
　第14屆飼料商業(yè)配方師研習(xí)班在上海成功召開，以下的問題來自討論環(huán)節(jié)的問題。

　　1.如何評(píng)估螯合微量元素效價(jià)？

　　傳統(tǒng)微量元素生物學(xué)效價(jià)是指動(dòng)物從一種特定形式的微量元素化合物（如螯合物）中吸收利用該元素（如鋅）的程度。實(shí)際生產(chǎn)中，某種形式的微量元素的生物學(xué)效價(jià)常用測(cè)定其與該元素另一形式或“標(biāo)準(zhǔn)形式”的效價(jià)的比值來表示。在測(cè)定有機(jī)微量元素生物學(xué)效價(jià)的試驗(yàn)中，常以微量元素?zé)o機(jī)鹽作為其標(biāo)準(zhǔn)形式，如硫酸鋅。目前微量元素生物效價(jià)的評(píng)估方法根據(jù)螯合元素的結(jié)構(gòu)及其功能的不同，有多種方法，如組織含量測(cè)定法、斜率比法、微量元素依賴性生物標(biāo)記法和元素的功效分析法等。組織中微量元素水平實(shí)際上反映的是組織中的儲(chǔ)存量，而不是吸收后輸送到特定組織的微量元素總量。通常，組織中微量元素的儲(chǔ)存量會(huì)受到排泄、利用或應(yīng)激的影響。因此，測(cè)定組織中的微量元素只能反映部分情況。為了真實(shí)地反映生物學(xué)效價(jià)，需要通過多種方法來綜合測(cè)定產(chǎn)品的生物學(xué)效價(jià)很重要，僅通過一種方法測(cè)定是不全面的。如鋅的生物學(xué)效價(jià)，可通過測(cè)定脛骨中鋅的含量和小腸金屬硫蛋白mRNA 的表達(dá)量，以及體內(nèi)與鋅相關(guān)酶的活性如SOD酶活等來綜合評(píng)估。

　　實(shí)際上，除了傳統(tǒng)的生物學(xué)效價(jià)定義，最近的研究結(jié)果顯示蛋氨酸羥基類似物螯合微量元素的優(yōu)勢(shì)不僅限于吸收率高，例如可以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，減少脛骨的軟骨發(fā)育不良及足底組織損傷，減少腿部畸形（弓形腿，外翻足，顫抖腿）并增加骨強(qiáng)度，降低氧化應(yīng)激和提高生長(zhǎng)性能；而且螯合微量元素的應(yīng)用，可以降低微量元素添加水平，節(jié)約礦產(chǎn)資源，減少環(huán)境污染，有如環(huán)保等諸多方面的效益，這些都是傳統(tǒng)效價(jià)評(píng)估所不能體現(xiàn)的。

　　2.氨基酸金屬螯合物的解離，pH降低時(shí)，平衡會(huì)出現(xiàn)左移金屬離子解離嗎？左移時(shí)隨著pH上升，會(huì)有什么變化？

　　氨基酸螯合鹽在溶液中會(huì)有解離平衡，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，有對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定常數(shù)。在達(dá)到平衡態(tài)后，降低pH時(shí)（使環(huán)境呈酸性方向），溶液中H+增加，平衡向生成氨基酸的方向，金屬離子與氨基酸配體的解離會(huì)增加，游離金屬離子濃度增加；當(dāng)達(dá)到平衡態(tài)后升高pH（使環(huán)境呈堿性方向），也會(huì)破壞原有的平衡，造成螯合物解離增加。

　　pH變化后，螯合物解離的程度與螯合鹽的穩(wěn)定常數(shù)有關(guān)，穩(wěn)定常數(shù)與所用的氨基酸配位體和微量元素都有關(guān)，同一種微量元素，不同的氨基酸，穩(wěn)定常數(shù)不同；同一種氨基酸配位體，與不同金屬元素所得螯合鹽的穩(wěn)定常數(shù)也不同。穩(wěn)定常數(shù)低的解離多，穩(wěn)定常數(shù)高的解離少。羥基蛋氨酸螯合微量元素穩(wěn)定性好，解離的少。部分螯合物的穩(wěn)定常數(shù)logK見下表1。

　　從表1的數(shù)據(jù)可以看到微量元素氨基酸螯合物的穩(wěn)定常數(shù)都在103~6或103~10，而有機(jī)酸的穩(wěn)定常數(shù)大于102，EDTA的穩(wěn)定常數(shù)都大于1013，螯合物的穩(wěn)定常數(shù)過低和過高都會(huì)影響動(dòng)物的吸收和利用。同一種氨基酸與不同金屬元素形成的螯合物穩(wěn)定常數(shù)亦有差別；金屬元素與氨基酸的摩爾比時(shí)穩(wěn)定常數(shù)增大很多。動(dòng)物試驗(yàn)研究和實(shí)際生產(chǎn)效果都表明：羥基蛋氨酸螯合微量元素在單胃動(dòng)物胃中的不易溶性，有利于螯合物保持穩(wěn)定性，這種胃中不易溶解的特性并不影響微量元素在小腸中溶解吸收。

表1  部分螯合物的穩(wěn)定常數(shù)logK

　　3.如何測(cè)氨基酸含量和微量元素含量？

　　根據(jù)配位體的組成和比例不同及微量元素的特性，可選用的方式有紅外光譜法、液相色譜法、原子吸收法、質(zhì)譜儀、液質(zhì)聯(lián)用，等多種方法。如羥基蛋氨酸螯合銅，可以采用傅立葉紅外光譜法，測(cè)定相關(guān)指紋峰的變化情況，與標(biāo)準(zhǔn)品所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，回歸分析得到氨基酸含量數(shù)據(jù)。

　　4.紅外光譜檢測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)？

　　優(yōu)點(diǎn)，直接，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，不需要液體狀態(tài)；

　　缺點(diǎn)，儀器設(shè)備昂貴，需要有純的結(jié)晶標(biāo)準(zhǔn)品。

　　5.怎樣區(qū)別真假螯合？

　　一般采用先定性再定量的方法。先用相應(yīng)微量元素有機(jī)和無機(jī)態(tài)的理化特性，鑒別是有機(jī)還是無機(jī)，或通過較為復(fù)雜理化分析方法紅外光譜、示差測(cè)熱、X射線衍射可以鑒定螯合物產(chǎn)品和混合物。如觀察無機(jī)鹽和螯合鹽顏色的差異、溶解特性、用顯微鏡觀察產(chǎn)品結(jié)晶的不同，并結(jié)合定量鑒定分析來鑒別。 如：蛋氨酸鉻與無機(jī)鉻、無機(jī)鉻＋蛋氨酸，用甲醇提取后觀察提取液顏色，蛋氨酸鉻為紅紫色，無機(jī)鉻和無機(jī)鉻＋蛋氨酸為深綠色。

　　6.關(guān)于螯合率？農(nóng)業(yè)部標(biāo)簽？品控方法建立？

　　農(nóng)業(yè)部標(biāo)簽法的正式實(shí)施，有利于真假螯合微量元素的甄別。如果產(chǎn)品有可行可靠的測(cè)定方法證明產(chǎn)品是真正螯合微量元素，才允許在標(biāo)簽上打“螯合”這一關(guān)鍵詞，只能用微量元素與氨基酸的混合物、復(fù)合物等關(guān)鍵詞，而不能用某氨基酸螯合微量元素。

　　對(duì)于品控方法的建立，可以按照前面的定性方法評(píng)估之后，確定為真正螯合的微量元素產(chǎn)品的情況下，再對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。定量測(cè)定的指標(biāo)有氨基酸和微量元素含量及螯合率等。

　　重點(diǎn)和難點(diǎn)是螯合率的測(cè)定。螯合率是指有機(jī)微量元素產(chǎn)品中螯合元素量占總元素量的比例。在螯合物的實(shí)際應(yīng)用中，人們經(jīng)常把“螯合率”看作一種反應(yīng)得率。檢測(cè)螯合率的方法目前有液體法和固體法兩種，其中液體法又分兩和種，一種是國標(biāo)GB/T13080.2-2005中運(yùn)用凝膠色譜法進(jìn)行檢測(cè)，通過將氨基酸螯合物試樣在水中加熱、離心后，分成沉淀和溶液兩部分。溶液中所含的可溶性氨基酸鰲合物及金屬離子經(jīng)過凝膠分離，在規(guī)定條件下洗脫，金屬離子形成氫氧化物沉淀，將固定在凝膠柱頂端無法洗脫，可溶性氨基酸螯合物則可通過配體氨基酸的攜帶從凝膠柱上洗脫下來，實(shí)現(xiàn)和金屬離子的分離;可溶性氨基酸螯合物洗脫分離完成后，加人EDTA溶液洗脫，使金屬離子從色譜柱上洗脫。用原子吸收光譜法測(cè)定沉淀態(tài)氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物及金屬離子的含量，分別計(jì)算出沉淀態(tài)氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物占金屬元素總量的比例即可計(jì)算出相應(yīng)的氨基酸螯合物的螯合率。但是此方法在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中檢測(cè)極不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)同一批樣品多次檢測(cè)結(jié)果不一致的現(xiàn)象。另外一種方法就是采用甘氨酸亞鐵國標(biāo)中檢測(cè)甘氨酸進(jìn)行評(píng)判，因?yàn)槟骋环N特異性氨基酸螯合物中只存在一種氨基酸，如甘氨酸亞鐵中只存在甘氨酸，那么我們就可以檢測(cè)總甘氨酸的含量，再檢測(cè)游離甘氨酸的含量，用總甘氨酸的含量減除游離甘氨酸的含量，再除以總甘氨酸的含量就可以間接折算出螯合率。此種方法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確性高，適合飼料企業(yè)實(shí)驗(yàn)室操作。

　　液體法針對(duì)的是溶解性好的螯合元素產(chǎn)品，主要是單體氨基酸螯合微量元素，如果是不溶或難溶的，用液體法難以測(cè)定螯合率，而且在液體在螯合鹽會(huì)有解離，且受環(huán)境中多種因素影響，溶劑的pH 值和濃度對(duì)礦物質(zhì)螯合率的影響很大，會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。盡管微量元素體內(nèi)研究已有一定基礎(chǔ)，但是在理想緩沖液中定量測(cè)定平衡螯合物的結(jié)果與體內(nèi)真實(shí)環(huán)境相比，依然相差甚遠(yuǎn)。消化系統(tǒng)內(nèi)部并不是平衡狀態(tài)，除水和緩沖液，還有各種陰離子、陽離子、酶、氨基酸等成分。所以，體外液體狀態(tài)不能完全代表體內(nèi)環(huán)境，因體內(nèi)環(huán)境無法達(dá)到平衡狀態(tài)。該方法能測(cè)定螯合物的螯合率和溶液中樣品的螯合率，但不能測(cè)定固體樣品的螯合率。因此，液態(tài)狀態(tài)下的螯合率并不能反應(yīng)原產(chǎn)品的螯合效果。

　　因此，固體狀態(tài)是測(cè)定螯合微量元素產(chǎn)品質(zhì)量和均勻度的首選，特別是用于比較不同的固體有機(jī)微量元素產(chǎn)品時(shí)。通過檢測(cè)螯合程度，我們可以確定終產(chǎn)品的質(zhì)量。為了獲得最精確的結(jié)果，產(chǎn)品應(yīng)以固體狀態(tài)檢測(cè)。諾偉司開發(fā)并驗(yàn)證了傅里葉紅外光譜法（FTIR），分析HMTBa與金屬元素結(jié)合的螯合物。該方法通過標(biāo)準(zhǔn)品曲線，能定量檢測(cè)出游離或未反應(yīng)的HMTBa 含量，以及產(chǎn)品中螯合物的總量。


　　感謝諾偉司公司對(duì)答案的貢獻(xiàn)，在此表示感謝！