益生菌、胃腸道微生物和宿主之間相互作用的研究進展

畜牧編輯

　　導讀

　　益生菌是乳制品和功能性食品工業的重要組成部分，帶來了數十億美元的市場。益生菌的多方面作用包括預防感染，降低腹瀉發病率，抗微生物活性，病原菌的競爭性排斥，免疫耐受，減少大腸癌生物標志物，上皮屏障功能，增加細胞免疫力，增加體液反應，降低血膽固醇水平，減少過敏腸道疾病癥狀等。目前研究的大多數益生菌來自乳桿菌屬和雙歧桿菌屬。乳酸桿菌與發酵產品相關，尤其在奶制品中應用最多。最近向食品中添加雙歧桿菌的研究不斷增多，大多作為有益添加劑。多數菌種天然存在于胃腸道， 這些微生物通常能夠抗酸、耐受膽汁。某些菌株還具有發酵果糖諸如人類不能消化的低聚果糖（FOS） 和半乳甘露寡糖（GOS）的能力，這些果糖能為胃腸道內的一些共生菌和益生菌提供一定生長優勢。

　　胃腸道是一個約有500 種、100 萬億微生物的復雜器官， 大概是人類體內細胞總數的10 多倍。對于這些細菌的遺傳組成成分，可以在胃腸道中翻譯編碼成具有大量生理功能的基因儲存器，對人體宿主的胃腸道產生有益作用。胃腸道已經演變成為一個營養和微生物豐富的生存部位，細菌在其中不斷地旺盛生長。組學技術諸如轉錄組技術、宏基因組學和代謝組學的使用，促進人們了解胃腸道中益生菌如何生長以及共生菌如何發揮作用。此外，這些技術有助于了解益生菌和共生菌之間以及宿主胃腸道相互之間的聯系。在此之前，基于實驗技術的限制，細菌純培養方法選擇的限制導致對胃腸道內菌種鑒定不充分。最近，16SrRNA 基因測序的廣泛使用，大量的新品種得到鑒定并確定胃腸道中大量的細菌屬于擬桿菌門（Bacteroides）和厚壁菌門門類（Firmicutes phyla）。

　　華盛頓大學Jeffrey Gordon 組的研究表明，以低脂肪或低碳水化合物飲食的較瘦人群， 其脂肪減少的同時伴有厚壁菌與擬桿菌數量之比下降。進一步研究發現， 即使當相同物種的哺乳動物存在巨大的地理差異時， 相同物種內的腸道微生物依然比不同物種間更為相似。這些研究表明，宿主和微生物群明顯是共同進化的， 且腸道菌群對人類健康具有重要貢獻。

　　胃腸道中宿主微生物相互作用的最佳位置在粘膜中。粘膜中的細菌維持腸道動態平衡，調控免疫系統并使之處于免受病原體入侵的最佳狀態。例如， 固有腸道菌群通過競爭排斥競爭抗菌物質的營養、受體結合位點以及產物，來幫助宿主阻止病原菌的入侵。通過受體和不同類型的免疫細胞，胃腸道內免疫系統不斷感應管腔內環境。單層腸上皮細胞將腸腔從固有層區分開。胃腸道內腸道菌群和腸道間存在微妙的作用平衡， 這一平衡區分共生腸道菌群和入侵病原菌。從胃腸道周圍抽取樣本，其中重要細胞是腸道上皮細胞（IECs）、M細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞（DCs）。腸道上皮細胞除了運送可溶性抗原，還顯示模式識別受體，諸如Toll 樣受體（TLRs） 和含有核苷酸結合寡聚樣（（NOD）-like）受體（NLRs）。M 細胞是缺乏微絨毛的上皮細胞， 位于細胞的基部， 其作用是向B 細胞、T 細胞和巨噬細胞運輸抗原。取樣管腔內容物顯示， 樹突狀細胞延伸其樹突穿過腸道上皮細胞層，卻沒有破壞腸道上皮細胞間的緊密連接。許多免疫細胞表面的Toll 樣受體（TLRs）依賴不同免疫刺激而反應不同， 因此提供免疫系統辨別腸道微生物和病原菌。例如Toll 樣受體2（TLR2）可以識別革蘭氏陽性菌細胞壁成分如脂磷壁和肽多糖，而Toll 樣受體4（TLR4）可以識別主要來源于革蘭氏陰性菌的脂多糖。腸道菌群Toll 樣受體（TLRs）活性對腸道平衡和腸道受損保護也是必需的。被確定為胃腸道和腸道菌群相互作用調節者的另一模式識別受體是可溶解的細胞質NLRs，被證明是對Toll 樣受體（TLRs ）的補充與協調。這些受體的激活包括NF-κB（κ 基因結合核因子）和MAPK（有絲分裂原活化蛋白激酶）級聯誘導導致重要免疫因子的刺激，這些免疫因子包括炎癥趨化因子、細胞因子和刺激分子。利用各生物部位信息了解腸道菌群。胃腸道益生菌作用涉及多學科研究領域，通過這些研究，逐步認識宿主和腸道菌群在腸道的相互作用。

　　1胃腸道內益生菌的作用

　　為維持完整腸道屏障以確保腸道健康， 必須保持腸道動態平衡。屏障受損能導致許多腸道疾病包括病原菌感染、腸易激綜合癥（IBS）和克羅恩?。–rohn’s disease）。受損傷的腸屏障伴隨緊密連接下降和細胞凋亡增加， 這是腸道克羅恩病的一個例子。此外，缺乏免疫的腸屏障能導致粘膜免疫細胞對諸如來源于腸道菌群的管腔內容物的暴露，進而導致不正常免疫反應。動態平衡被認為是由上皮細胞，特別是粘膜樹突狀細胞維持。然而益生菌和腸道菌群在腸屏障功能和完整性方面也起到重要的調節作用。

　　緊密連接就是在相鄰上皮細胞間形成相對不通透屏障蛋白質復合物?？缟掀る娮铚y量（TER）是用于檢測上皮細胞緊密連接的屏障完整性的常用方法。利用增加體外細胞株跨上皮電阻測量，檢測益生菌對緊密連接有積極作用。腸道上皮細胞品系感染致病性埃希氏菌屬， 導致跨上皮電阻測量下降，上皮通透性提高和生理功能障礙。

　　腸道上皮細胞較早暴露給有活性的嗜酸乳桿菌而不是熱滅活嗜酸乳桿菌， 限制了大腸桿菌的不利影響。通過跨上皮電阻測量發現，嗜酸菌制劑能減少大腸桿菌誘導的緊密連接蛋白質的磷酸化作用。益生菌對屏障功能的其它積極影響表現在：阻止上皮細胞病原體入侵，產生防御分子，炎性細胞因子的衰減和細胞因子誘導細胞凋亡的預防。這些研究表明無論病原菌是否存在，益生菌對屏障完整性都有積極的作用。對大腸炎和敗血癥的動物模型研究表明， 腸道上皮細胞屏障功能增加歸因于益生菌活性。體內試驗以及轉錄能夠進一步闡明益生菌增加屏障完整性的機制。

　　由于樹突狀細胞在胃腸道粘液的細胞免疫中起關鍵作用， 所以由益生菌調制的樹突狀細胞是一個重要的研究領域。目前已證實益生菌能夠以菌株特有方式誘導樹突狀細胞而調控T 細胞，表明其在粘膜表面的重要作用。這一屬性被用于通過由嗜酸乳桿菌表達的保護性抗原靶向作用樹突狀細胞， 來保護小鼠免受炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）的致命侵害。最近調查顯示，益生菌作為胃腸道粘膜預防和保護分子的運載工具具有潛在細胞免疫功效。

　　細菌素是具有熱穩定性的、由許多乳酸菌產生的抗微生物小肽。通過去除細菌素產物的唾液乳桿菌（L. alivarius）衍生物，表明唾液乳桿菌保護小鼠免受李斯特菌（L. monocytogenes）感染的能力歸因于細菌素的產物。體外抵御病原體的抗微生物活性的方法還包括過氧化氫、乳酸、競爭排斥和免疫系統調控。雖然針對病原體的抗微生物活性的這些體內論證仍需證實， 但是由體外研究和文獻得出， 體內益生菌能發揮抗菌作用已有有力的證據。因抗生素可能對腸道微生物群有害，故能是一個令人興奮的研究領域。

　　細菌存活于腸道中， 一部分原因是其能夠影響宿主對出現的微生物競爭者的識別能力， 以及對傳感環境內其它成分和信號的分析能力， 這將有利于宿主協調營養需求。

　　細菌演變有不同的作用方式。雙組分調控系統（2CR）具有允許益生菌感應周圍環境的功能，并可啟動適當轉錄反應。這些系統由組氨酸蛋白激酶（HPK）和反應調節器（RR）構成。該HPK 接收到一個信號， 傳遞給反應調節器， 然后通過其DNA 結合結構域，誘導一個轉錄反應。其中2 個系統功能特點已經在嗜酸乳桿菌中得到確認——膽汁耐受和酸抵抗的作用。上述兩者是體現益生菌功能的關鍵點， 并對其能否存活于胃腸道有直接影響。此外，細菌素產量以種群密度依賴方式得到控制。小鼠胃腸道轉錄研究證實，來自植物乳桿菌細菌素操縱子的細菌素免疫蛋白在2 個相互獨立試驗中被誘導， 說明了植物乳桿菌這一基因在體內表達情況。缺乏細菌素生產能力的體內益生乳酸桿菌，如植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌，是否會引起不同宿主反應，令人非常感興趣。

　　備受關注的細胞對細胞作用的另一方法是群體感應分子AI-2 的產生。這一信號分子由luxS基因編碼，并在革蘭氏陽性和陰性菌中出現。在羅伊乳桿菌（L. reuteri）、植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌中，對luxS 基因功能均有研究。以羅伊乳桿菌為例，luxS 基因突變株表明在對數生長過程中ATP合成減少， 在小鼠胃腸道內特定生態位適應力下降且生物膜較對照組有所增厚。Lebeer 等也證明luxS 突變株對生物膜結構的影響歸因于代謝缺陷。其他研究也證實luxS 突變株在胃液中存活率降低，在小鼠胃腸道中保留時間縮短。這些研究表明，AI-2 信號的生態學和特定生態位的重要性以及它對胃腸道益生菌作用的潛在貢獻。AI-2的產量對宿主上皮基因表達可能有一個信號影響，諸如粘蛋白產量或者免疫調制信號。許多益生菌微生物內的傳感系統可能提高其棲息多種生態位以及與各種寄居在胃腸道內菌種的競爭能力。

　　2利用轉錄洞察胃腸道內微生物的作用
　　2.1 胃腸道中益生菌的轉錄反應

　　基因退化導致生物合成能力下降的事實證明許多益生菌能夠適應胃腸道的進化。此外，這些益生菌編碼著重要特征， 而這些特征同時保證其生存在惡劣的胃腸道環境中，諸如酸和膽汁抵抗，細胞表面存在蛋白質， 可以干擾腸道粘膜和復雜碳水化合物代謝。例如腸道乳桿菌編碼復合轉運蛋白促進直接來自胃腸道養分的糖和氨基酸吸收。Yuan 最近通過比較兔子腸道模型中體內與體外菌株生長蛋白質組學概況來研究宿主在長雙歧桿菌NCC2705 蛋白質組中誘導的變化。在體內長雙歧桿菌中，蛋白質諸如EF-Tu 粘附樣因子，膽鹽水解酶和應激蛋白水平上調。有趣的是，與體外條件相比，LuxS/AI-2 在體內也被誘導。羅伊乳桿菌、植物乳桿菌和約氏乳桿菌在小鼠胃腸道中的基因表達已有研究。

　　由Walter 等用體內表達技術（in vivo expressiontechnology，IVET） 最初僅鑒定了3 株在小鼠胃腸道表達的羅伊乳桿菌基因， 分別為木糖異構酶、蛋氨酸亞楓還原酶和編碼未知功能的蛋白質基因。使用改進的體內表達技術進行后續研究，鑒定了小鼠胃腸道植物乳桿菌72 種基因表達。這些基因涉及碳水化合物和氨基酸代謝， 應激性以及潛在的宿主相互作用的細胞外因素。

　　Denou 等通過基因表達研究發現， 在小鼠的胃、盲腸、空腸和結腸表達了不同的約氏乳桿菌基因簇， 這一現象證明不同基因表達概況依賴于轉錄位置， 如在胃、盲腸、空腸和結腸中分別發生786、391、296 和26 個基因轉錄。該小組還研究了約氏乳桿菌在腸中停留5 d 和12 d 后的基因表達，以鑒定與腸持久性表型相關的基因。與腸持久性表型相關的3 個基因座包括胞外多糖（EPS）的生物合成，一磷酸甘露糖磷酸系統（PTS）和可能的蛋白酶。突變株中蛋白酶和一磷酸甘露糖磷酸系統（PTS）的缺失降低了約氏乳桿菌在腸道停留時間，暗示這些基因座對腸道持久性起一定作用。此外eps 基因座缺失導致腸持久性略有提高。

　　研究分析了植物乳桿菌在無菌小鼠盲腸的基因表達圖譜， 向小鼠飼喂標準低脂肪或高脂肪的西式日糧， 以探討日糧對胃腸道益生菌基因表達的影響。低脂肪日糧含復合植物多糖高，而西式日糧含單糖和脂肪高。采食標準日糧的小鼠，其定植水平要高出10 倍，這是因為碳水化合物代謝和細胞表層功能細菌基因表達不同。研究人員認為，植物乳桿菌修改了它的基因表達，減少了細胞表面的LTA 水平。以此為手段限制對宿主免疫系統成分的暴露。此外，研究人員觀察到小鼠胃腸道內被誘導的18%的植物乳桿菌與其它腸乳酸桿菌有同源性，而不與其他乳酸菌存在同源性。許多基因與細胞表層未知功能或啟動細胞表層未知功能相關。這一結果反映了測序菌株間比較基因組分析的有效性。因為該技術強調食物適應乳桿菌如保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌與腸道適應乳桿菌如嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌間的差異。由于酸奶發酵劑已經歷了基因組衰變， 使保加利亞乳桿菌能夠適應營養豐富的乳環境，而用于轉運和代謝途徑的被編碼的益生乳桿菌， 可以促進其利用胃腸道多種碳水化合物來適應胃腸道環境。比較嗜酸乳桿菌和干酪發酵劑瑞士乳桿菌的基因組， 它們具有緊密相關性并分享75%共同基因。雖然它們具有相似性，但在基因集合上顯著不同，這說明其能夠適應不同的環境。例如，嗜酸乳桿菌利用復雜的碳水化合物， 如棉子糖和寡糖編碼粘液結合蛋白和轉運蛋白——這是益生菌的功能與其適應胃腸道環境這兩個重要特征。相反，瑞士乳桿菌缺乏這些基因集合， 而編碼用于脂肪酸合成和特定氨基酸代謝的其它基因。動物模型和人體系統的其它菌株測序以及胃腸道轉錄分析使人們進一步了解胃腸道內益生菌和共生菌功能。

　　2.2 胃腸道中微生物和益生菌相互作用

　　利用基因組序列和發展基因芯片技術， 有利于研究益生長雙歧桿菌NCC2705 和人類微生物區系的主要成分以及多形擬桿菌在小鼠胃腸道內如何對彼此存在作出反應。試驗中構建一個包含有寡核苷酸基因芯片技術， 該寡核苷酸類來自單芯片上每個基因組。該研究分別給小鼠飼喂單一菌株和聯合菌株。對無菌小鼠飼喂聯合菌株，可獲取多糖類物質，降解基因的擴增。就多形擬桿菌而言，表達的上調基因與碳水化合物運輸和代謝，能量產生，糖苷水解酶和多糖裂解酶相關。這些結果表明， 在長雙歧桿菌存在下由多形擬桿菌靶向定位的代謝多糖增加。

　　在長雙歧桿菌存在條件下， 來自淀粉利用系統的1/3 基因同族體在多形擬桿菌基因組中差異表達。最近有研究表明，由擬桿菌門淀粉利用系統（starch utilization system）利用胃腸道復雜聚糖類物質，提供了每日攝入熱量的10%。擬桿菌門對原本不可消化的碳水化合物的發酵能力， 表明了這些腸道細菌的重要性能。相比之下，聯合定植后的長雙歧桿菌較少改變表達基因， 與多形擬桿菌相比，分別為3.5%對14.2%。進一步分析揭示，在長雙歧桿菌存在條件下與多形擬桿菌木糖苷降解和木糖分解代謝相關的基因上調以及與兩菌株甘露糖降解有關的基因差異表達， 尤其在聯合定植過程中， 多形擬桿菌和長雙歧桿菌分別對甘露糖苷酶基因增量調節和減量調節。這些結果表明在長雙歧桿菌存在時多形擬桿菌可以鎖定胃腸道中額外多糖來源。此外，多形擬桿菌與干酪乳桿菌或動物雙歧桿菌聯合定植轉錄反應不如長雙歧桿菌引起的強烈。動物雙歧桿菌可以誘導與轉錄和復制相關的多形擬桿菌基因， 而干酪乳桿菌則誘導用于碳水化合物運輸代謝和無機離子運輸代謝的基因。由于3 株菌株引發了在程度和類型上都存在差異的多形擬桿菌不同轉錄反應， 該研究揭示腸道細菌之間發生的重要本質關系。

　　2.3 胃腸道對益生菌的轉錄反應

　　胃腸道內益生菌作用的確切機制并不完全清楚，其相互作用是多方面的。通過宿主轉錄反應分析， 特定免疫細胞以及免疫因子應答研究揭示了多種細胞類型和效應分子以及細胞受體和細胞信號分子的參與情況。此外，不同的品種和品系表現出細胞信號起始的多樣化和差異程度， 這反過來又導致健康或疾病的不同結果。根據以上討論的研究，Sonnenburg 等（2006）通過調查同一只小鼠腸道上皮水平的宿主反應， 也驗證了宿主對多形擬桿菌和長雙歧桿菌聯合定植反應。單一菌株定植和聯合菌株定植宿主反應是不同的。分析表明，宿主對多形擬桿菌反應集中在TNF-α、T 細胞和巨噬細胞， 然而宿主對長雙歧桿菌的反應集中在IFN-γ。在聯合定植試驗中，先天免疫的兩個菌株基因協同誘導。鼠胃腸道中由長雙歧桿菌誘導的另一反應是下調抗菌蛋白的能力。Reg3γ（再生胰島衍生蛋白3γ）被多形擬桿菌上調。

　　研究人員分析了益生菌在健康人體十二指腸中基因的轉錄。在一個隨機雙盲安慰劑對照交叉研究中， 對健康受試者給予益生植物乳桿菌WCFS1。結果確定了在粘膜表面和細胞途徑內與免疫耐受相關的基因表達模式。從十二指腸取樣對對數生長細胞、靜止細胞或死細胞處理6 h后用于分析。3 種條件都導致免疫應答相關基因的誘導。對數生長期細胞（logrimithic phasecells）和固定期細胞（stationary phase cells） 的誘導類型存在差異。固定期細胞誘導與免疫耐受建立相關基因，諸如NFκB （κ 基因結合核因子）和轉錄因子JUN， 而對數生長期細胞誘導針對代謝功能反應。另外，眾多細胞過程的基因表達也存在差異，包括免疫調制、細胞凋亡、細胞對細胞信號、細胞循環和細胞粘附。本討論結果，支持了胃腸道益生菌的作用，并顯示其潛能。人們還期待著人類和動物模型胃腸道中基因表達的其它研究結果。

　　3未來展望

　　盡管胃腸道和腸道菌群間相互作用仍不完全清楚， 但胃腸道內益生菌間的相互作用是巨大且多方面的。其它方面，如益生元與益生菌向胃腸道投放以及交互作用類型需要考慮。這些條件可能會增加或減少益生菌產生的有益效應。

　　最近對大腸癌小鼠模型的一個研究表明：配方酸乳粉包埋的嗜酸乳桿菌比單獨使用益生菌的積極作用會增強。其他研究還加入基體效應的影響，如乳基對益生菌基因表達的影響。為維持胃腸道中益生菌健康屬性， 所加入的最優條件是很重要的。

　　毫無疑問， 利用遺傳手段促進了人們對胃腸道中菌群復雜性的了解。我們掌握了腸道菌群的作用，而且遺傳手段在不斷改善，諸如構造缺乏一個或多個蛋白質菌株， 使我們能通過分析特定蛋白質，以確定其在益生功能中的作用。例如對于基因失活或缺失的嗜酸乳桿菌， 利用遺傳技術證實了重要益生菌的特征，如細胞表面因子，包括S層蛋白，膽汁耐受，酸性壓力，FOS 的轉運和代謝，LuxS/AI-2，細菌素運輸和草酸鹽降解。這些特征對益生菌在人類健康中的作用有重要的貢獻。例如為研究在正常腸道的平衡條件以及感染大腸炎等疾病條件下上述特征的重要性， 體內研究是很重要的。上述討論中，在病原體抑制，屏障功能維持和免疫系統調節中益生微生物的潛能都得到了證實。由于益生菌株能夠產生抗菌化合物，導致表層因素的存在或缺失， 從而誘導粘膜表面親炎或抗炎反應能力或發酵胃腸道復合多糖的能力，且不同的益生菌株會帶來不同的健康益處， 因此需要做進一步的體內研究，尤其是以人體為受試者，測定菌株， 劑量和胃腸道益生菌的特定位點健康效應。

　　作者：王麗鳳，張和平
　　轉自：中國食品學報