實驗室工作須知及簡單操作方法

sdjgq · 發表于 2006-10-20 20:05:55

一、實驗須知
在微生物的實驗中，要求工作謹慎，嚴防實驗室污染，防止事故，有科學態度。
1.嚴格防止病原微生物散布
第一，在實驗室工作，應穿戴工作衣帽，每天實驗結束后，要將這些衣帽浸于消毒藥水中(如5％石炭酸)或高壓消毒后再進行洗滌。
第二，沾有病原微生物的器皿及廢棄培養物，應置于指定的地點，消毒后再進行洗滌。檢查用過的動物尸體、臟器、血液等病料，應嚴加消毒，深埋或焚燒。
第三，接種環、接種針等器械，用前用后必須置火焰中燒灼。
第四，含有培養物的試管，應豎列在試管架上，不可平放在桌子上，以防其中液體流出，污染桌面和地面。

第五，實驗室中禁止飲食、吸煙及用嘴濕潤鉛筆和標簽等物，也不要以手指等與面部接觸。
第六，進行危險病科檢驗時不要互相交談或思考其他問題，以免分散注意力而發生意外。
第七，實驗室中若發生意外，如工作人員吸入細菌，劃破皮膚，細菌或病料污染桌面或地面時，人員應立即自行處理，必要時到醫院就醫，被病原微生物污染的地點，應敷以濃消毒藥(5％石炭酸等)覆蓋過夜。
第八，菌種或毒種不得隨意帶出實驗室，若必需帶出時，應嚴格按規章制度辦理。
第九，工作完畢后應先用消毒藥水泡手，后用清水沖洗。
2.預防火災發生
一切易燃品應遠離火源。不可將酒精燈傾向另一酒精燈引火，以免發生爆炸。電爐用完后應立即斷電。電器發生故障應立即修理。
3.標記和記錄
標記和記錄所有各種試劑、染料、培養物等，均需標記明確。每日操作及觀察結果，均應詳細記錄。
4.保持清潔衛生與秩序井然
每日工作前，應清潔地面、桌面。實驗室中的物資、器具，存放要有一定位置，工作結束后放回原處或指定地點。每日下班前，搞好實驗室的清潔衛生和器具整理。
二、玻璃器皿的準備
微生物實驗室應用的玻璃器皿種類很多，在選購時注意各種規格和質量，一般應能耐受多次高溫滅菌，且以中性者為宜。玻璃器皿用前必須干燥清潔，而且要絕對無菌。

1.新購入玻璃器皿的處理
新購的玻璃器皿，常附有游離堿質，不可直接使用，應先在1％～2％鹽酸溶液中浸泡數小時，以中和其堿質，然后再用肥皂水及清水刷洗，以除去遺留的酸質。
2.用過的玻璃器皿的消毒和處理
凡被病原微生物沾污過的玻璃器皿，在洗滌前必須進行嚴格的消毒。
第一，一般玻璃器皿(如平皿、試管、燒杯、燒瓶等)均可置高壓消毒器內在15磅壓力下消毒20～30分鐘。
第二，吸管、載玻片、蓋玻片等可浸泡于5％石炭酸溶液或2％～3％來蘇兒溶液中浸泡48小時。浸泡吸管的玻璃筒底部應墊以棉花，以防投入吸管時碰破。

第三，盛有固體培養基(如瓊脂)或沾有油脂(如液體石蠟或凡士林等)的玻璃器皿，應于消毒后，隨即趁熱將內容物倒凈，用溫水沖洗，再以5％肥皂水煮沸5分鐘，然后以清水反復沖洗數次，倒立使之干燥。
3.玻璃器皿的洗滌
第一，將消毒處理過的玻璃器皿浸泡于洗衣粉水中，用試管毛刷反復刷去油脂和污垢，然后用自來水沖洗數次，最后用蒸餾水沖洗。
第二，經清水沖洗后，如發現玻璃器皿上仍有油跡時，可放入1％～5％蘇打水或洗衣粉水中煮沸半小時，再用毛刷刷去油脂和污垢，最后用清水或蒸餾水沖洗干凈。
第三，吸管的洗滌：①將吸管從消毒劑中取出后，先用細鐵絲取出管口的棉塞。若棉塞太緊不易取出時，可將鐵絲尖端壓扁，插入棉塞和管壁之間，輕輕一轉，即可將棉塞拉出。②將吸管浸泡于5％熱洗衣粉中，在細鐵絲一端，纏以少許棉花，用以刷洗管內的油脂和污垢。③用膠皮管1根，一端接沖棉球，一端接吸管的尖端，在流動的清水或自來水中反復吸沖數次，最后用蒸餾水吸沖數次，倒立于墊有紗布的鐵絲筐或其他容器中。

4.玻璃器皿的干燥
洗凈的玻璃器皿通常倒立于干燥架上，令其自然干燥，必要時也可放在50℃左右干燥箱中加速干燥。當然溫度不宜太高，以免造成破裂。干燥后以干凈的紗布或毛巾擦去水跡，再作進一步的處理。
5.玻璃器皿的包裝
玻璃器皿在消毒之前，須包裝妥當，以免消毒后又被雜菌所污染。各種玻璃器皿的包裝方法如下：
第一，一般玻璃器皿(試管、三角瓶)的包裝，先做好大小適宜的棉塞或紗布塞，將試管或三角瓶塞好，外面再用紙包扎。燒杯可直接用紙包扎。
第二，吸管先用細鐵絲或長針頭塞少許棉花于吸管口端，以免使用時將病原微生物吸入口中，同時又可濾過從口中吹出的空氣。棉花應大小適度，以不緊不松為宜。最后將吸管一一分別用紙包裹，再用其他紙每10支包成1束。

第三，平皿、培養扁瓶、青霉素瓶等，用無油質的紙將其單個或數個包成1包，置金屬盒內或直接進行消毒。
6.載玻片、蓋玻片的處理
用過的載玻片和蓋玻片，須分別浸泡于2％來蘇兒或5％石炭酸溶液內消毒，經48小時后取出，再放入含5％洗衣粉的水中煮沸30分鐘，用清水沖洗干凈，試干保存，或浸于95％酒精中備用。
7.玻璃器皿用前的消毒
普通玻璃器皿在用前應經干熱消毒法(160～180℃，1～2小時)消毒，也可用高壓消毒法(15磅壓力下，20～30分鐘)消毒。
8.玻璃器皿云霧狀污垢的處理
凡玻璃器皿上有云霧狀而不能用普通方法洗凈時，可用清潔液浸泡24小時，再以清水洗去清潔液，然后用洗衣粉水刷洗干凈為止。若仍洗不凈時應廢棄。清潔液可重復應用多次，直至顏色變為藍綠色或黑色為止。

清潔液的配制：取重鉻酸鉀10克，溶于63毫升常溫清水中，配成重鉻酸鉀飽和溶液。再吸取此溶液35毫升，加入粗質濃硫酸1000毫升中即成。
三、細菌涂片的制備及染色
1.細菌涂片的制備
(1)玻片準備：載玻片應該清潔、透明而無油漬，滴上水后，能均勻展開。如有殘余油漬，可按下列方法處理：①滴上95％酒精2～3滴，用潔凈紗布擦拭，然后在在酒精燈火焰上輕輕通過幾次。②若上法仍未能去除油漬，可再滴上1～2滴冰醋酸，再在酒精燈火焰上輕輕通過。
(2)涂片：①液體材料(如液體培養物、血液、滲出液)，可直接用滅菌接種環取一環材料，置于玻片中央，均勻地涂布成適當大小的薄層。②固體材料(如菌落、膿、糞便等)，則應先用滅菌接種環取少量生理鹽水或蒸餾水，置于玻片中央，然后再用來菌接種環取少量液體，在液體中混合，均勻涂布成適當大小的薄層。③組織臟器材料，先用鑷子夾住局部，然后用滅菌的剪刀取1小塊，夾出后將其新鮮切面在玻片上壓印或涂抹成一薄層。如有多個樣品同時需要制成涂片，只要染色方法相同，也可以在同一張玻片上，先用蠟筆劃分成若干小方格，每方格涂抹一種樣品。需要保留的標本片，應貼標簽，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。

(3)干燥：上述涂片，均應讓其自然干燥。
(4)固定：有火焰和化學兩種固定方法。
①火焰固定：將干燥好的涂片涂面向上，以其背面在酒精燈上來回通過數次，略作加熱固定。
②化學固定：干燥涂片用甲醇固定。
2.染色
(1)革蘭氏染色：①將已干燥的涂片用火焰固定。②在固定好的涂片上，滴加草酸銨結晶紫染色液，經1～2分鐘，水洗。③加革蘭氏碘溶液于涂片上媒染，作用1～3分鐘，水洗。④加95％酒精于涂片上脫色，約30秒鐘，水洗。⑤加稀釋石炭酸復紅(或沙黃水溶液)復染10～30秒鐘，水洗。⑥吸干或自然干燥，鏡檢可見：革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

(2)瑞氏染色法:涂片自然干燥后，滴加瑞氏染色液，為了避免很快變干，染色液可稍多加些，或者看情況補充滴加。經1～3分鐘再加約與染色液等量的中性蒸餾水或緩沖液，輕輕晃動玻片，使與染液混勻。約經5分鐘左右，直接用水沖洗(不可先將染液傾去)，吸干或烘干，鏡檢可見：細菌為藍色，組織、細胞等物呈其他顏色。
(3)染色液的制備：
①革蘭氏染色液的配制：
結晶紫染液：甲液：結晶紫2克，95％酒精20毫升；乙液：草酸銨0.8克，蒸餾水80毫升。
先將甲液稀釋5倍，加20毫升，再加乙液80毫升，混合即成。此液可較久儲存。革蘭氏碘溶液：碘片1克，碘化鉀2克，蒸餾水300毫升。

先將碘化鉀加入3～5毫升的蒸餾水中溶解后再加碘片，用力搖勻，使碘片完全溶解后再加蒸餾水至足量(直接將碘片與碘化鉀加入蒸餾水中，則碘片不能溶解)。革蘭氏碘溶液不能久藏，1次不宜配制過多。
復染劑：番紅(沙黃)復染液：2.5％番紅純酒精溶液10毫升，蒸餾水90毫升，混合即成。堿性復紅復染液：堿性復紅0.1克，蒸餾水100毫升。
②瑞氏染色液的配制：瑞氏染色劑粉0.1克，純粹白甘油1毫升，中性甲醇60毫升。
置染料于一干凈的乳缽內，加甘油后研磨至細末，再加入甲醇使其溶解。溶解后盛于棕色瓶中，經1周后，過濾，裝于中性的的棕色瓶中，保存暗處。該染色劑保存時間愈久，染色的色澤愈鮮。

四、病毒的雞胚培養
許多病毒均能在雞胚上發育繁殖。因此，利用雞胚培養病毒就成為病毒學上的一種常用的方法，用它可以分離、鑒定某些病毒，制備一些抗原，生產一部分疫苗。
(一)材料與設備
(1)常選用健康白色雞的受精蛋，通常用產后10天之內的新鮮雞蛋。
(2)孵化器可購置1具小型孵化器。
(3)檢蛋蛋燈及暗室檢蛋燈分固定及手持式兩種。
①固定式檢蛋燈：為一方形木盒，在底部或一側裝100W燈泡1個。上蓋開一蛋形孔，周圍包以棉布或膠皮，使之適于放置雞蛋而不露光，在暗室中即可檢蛋或定胎位。如無暗室，用黑布覆蓋檢查者的頭部及木盒，也能檢蛋。

②手持式檢蛋燈：為一有柄圓形筒，內裝60W燈泡1個，筒端口緣包以膠皮，柄上附開關，在暗室中持燈將筒口罩于豎立蛋上，即可觀察胚胎發育狀況，使用方便。
(4)開蛋器市上買的鋼錐或獸用采血針頭，均可用來鉆孔。牙科磨牙機或電烙器，可用于開蛋窗。
(5)蛋盤及蛋座蛋盤為盒形木制，在上層板上開略小于雞蛋的圓形或橢圓形孔數行，圓形孔可豎立放置待檢蛋，橢圓形孔可橫臥放置待檢蛋。定胎位后，接種、解剖及固定培養時，使用此盤。
蛋座為小方形木盒，上有圓形或橢圓形孔1個，供接種或解剖收獲時用。
(6)接種罩及紫外線燈接種或收獲時，為了避免污染及傳染，必須在接種罩中操作。罩內裝置紫外線燈，以便消毒。

除上述材料與設備外，還需1～5毫升注射器、膠皮乳頭、無菌滴管、玻璃紙或電工用透明膠紙、病毒保存液(緩沖甘油液或50％兔血清緩沖鹽水)、滅菌培養皿、乳缽、玻璃研磨器、鑷子、剪子以及各種消毒液(3％碘酊、酒精棉球、3％來蘇兒)等。
(二)操作技術
1.雞胚的孵化及檢蛋
將選好的雞蛋，先用溫水洗凈，并用酒精紗布擦拭后，放入37.5～38℃，濕度為45％～60％的孵蛋箱內，每日孵蛋2～3次。孵后第四天開始用檢蛋燈照視發育情況，若僅見模糊的蛋黃黑影，無雞胚跡象，則為未受精蛋；4日后若見清晰血管小團，其中有雞胚暗影，較大的雞胚則可見到胚動，則為活雞胚；雞胚活動呆滯或不能主動運動，血管昏暗或斷折沉落，則為瀕死或死亡雞胚。

2.雞胚的接種法
包括卵黃囊接種法、絨毛尿囊膜接種法、尿囊接種法、囊膜接種法、靜脈接種法、腦內接種法等。現將絨毛尿囊膜接種法及尿囊接種法介紹如下：
(1)絨毛尿囊膜接種法：
①接種步驟：選用孵化10～12天的雞胚，劃出氣室及絨毛尿囊膜的發育面，在絨毛尿囊膜處(靠近胚胎而無大血管處)蛋殼上，用碘酊及酒精消毒后，銼一個三角形或方形裂痕，除去蛋殼造成“蛋窗”，注意勿傷及蛋殼膜。另在氣室中心鉆小孔，將蛋橫臥于蛋盤(座)上，在殼膜窗上滴無菌鹽水1滴，以針尖將蛋殼膜劃破一小孔，不可傷及下面的絨毛尿囊膜，然后用膠皮乳頭置于氣室端之小孔處往外吸氣，使鹽水滲入殼膜與絨毛尿囊膜的裂隙內，此時絨毛尿囊膜即下陷，與殼膜完全分離，而形成人工氣室。以注射器注入0.05毫升病毒液于絨毛尿囊膜表面(應于造蛋窗后的1～2小時接種，否則干燥后不能用)，然后用玻璃紙蓋于蛋窗上，周圍涂以溶化的石蠟密封。同時封閉氣室端小孔。橫臥于蛋盤上，放在35～37℃溫箱內，不能翻動。每日自蛋窗檢查1次，如病毒發育良好，則雞胚通常在48～96小時內死亡。

②收獲方法：將待收獲的雞蛋蛋窗用碘酊消毒，用滅菌鑷子撕掉玻璃紙，擴大蛋窗，除去蛋殼膜，輕輕夾起絨毛尿囊膜，用小剪子沿人工氣室周圍將接種的絨毛尿囊膜全部剪下，放置在雙碟或玻璃板上，觀察病變。將病變顯著的部分，放入滅菌小瓶內保存。
(2)尿囊接種法
①接種步驟：選用孵化10～11天的雞胚經照視后，劃出氣室和胎位，在雞胚旁無大血管處用鉛筆劃一記號，用碘酊和酒精消毒后，以滅菌鋼錐在接種處鉆一小孔，只破蛋殼而不破殼膜。針頭沒小孔避開雞胚斜向刺入0.5～1.0厘米處，注入0.1～0.2毫升病毒懸液。用石蠟封口后，置溫箱內孵化。每日翻蛋兩次，檢查一次。

②直立收獲方法：收獲時間須根據所感染病毒種類而定。收獲前置冰箱中冰凍一夜，以免解剖時出血。收獲時將雞蛋放在蛋架上，用碘酊和酒精將氣室端消毒，用滅菌鑷子除去氣室部蛋殼及蛋殼膜，在絨毛尿囊膜無大血管處穿破，用吸管吸取尿囊液。每一雞胚約可得尿囊液5～6毫升，貯入小瓶中冰凍保存。??