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iamchina1221

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muyangxue1984

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muyangxue1984

總糖和還原糖的測(cè)定（二）
          ──3,5－二硝基水楊酸法

目的要求：

    掌握還原糖和總糖的測(cè)定原理，學(xué)習(xí)用比色法測(cè)定還原糖的方法。

實(shí)驗(yàn)原理:

在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測(cè)定樣品中的含糖量。


黃色                       桔紅色

試劑和器材
一、試劑
    3,5－二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.5g DNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氫氧化鈉溶液325ml，再加入45g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1000ml。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100ml，即含葡萄糖為2.0mg/ml。
    6mol/L HCl：取250ml濃HCl（35%～38%）用蒸餾水稀釋到500ml。
碘－碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。
6N NaOH：稱取120g NaOH溶于500ml蒸餾水中。
0.1% 酚酞指示劑。
   
  二、材料
藕粉，小麥淀粉或玉米淀粉。

三、器材
723PC、S22型分光光度計(jì)，天平，水浴鍋，電爐，試管若干等。
一、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
取5支15mm×180mm試管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水。

管號(hào)        　        葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液        蒸餾水        葡萄糖含量          OD540　
　        　        /ml        /ml        /mg        　
0                                    
1                   0
0.2        1
0.8        0
0.4         
2                 0.4        0.6        0.8         
3                 0.6        0.4        1.2         
4                  0.8        0.2        1.6         
5        　        1        0        2        　


操作方法

      
在上述試管中分別加入DNS試劑2.0ml，于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0ml，搖勻，在540nm波長處測(cè)定光吸收值。以1.0ml蒸餾水代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液按同樣顯色操作為空白調(diào)零點(diǎn)。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、樣品中還原糖的提取
準(zhǔn)確稱取 0.5g小麥（）粉，放在100ml燒杯中，先以少量蒸餾水(約2 ml)調(diào)成糊狀，然后加入40ml蒸餾水，混勻，于50℃ 恒溫水浴中保溫20min，不時(shí)攪拌，使還原糖浸出混。過濾，將濾液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為還原糖提取液。

    三、樣品總糖的水解及提取
準(zhǔn)確稱取0.5g小麥(玉米)淀粉，放在錐形瓶中，加入6mol/L HCl 10ml，蒸餾水15ml，在沸水浴中加熱0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液檢查水解是否完全。如已水解完全，則不呈現(xiàn)藍(lán)色。水解畢，冷卻至室溫后加入1滴酚酞指示劑，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，并定容到100ml，過濾取濾液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混勻，即為稀釋1000倍的總糖水解液，用于總糖測(cè)定。

    四、樣品中含糖量的測(cè)定
    取7支15mm×180mm試管，分別按下表加入試劑：
項(xiàng)目        空白        還原糖　        　總糖
H2O/ml        1        0        0        0        0
樣品溶液/ml        0        1        1        1        1
3,5-二硝基水楊酸試劑/ml        2        2        2        2        2
OD值/540nm                                       


加完試劑后，于沸水浴中加熱2min進(jìn)行顯色，取出后用流動(dòng)水迅速冷卻，各加入蒸餾水9.0ml，搖勻，在540nm波長處測(cè)定光吸收值。測(cè)定后，取樣品的光吸收平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的糖量。
五、結(jié)果處理
    按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量：
                     
式中：C──還原糖或總糖提取液的濃度，mg/ml；
V──還原糖或總糖提取液的總體積，ml；
            m──樣品重量，g；
1000──mg換算成g的系數(shù)。