請高手分析飼用植酸酶活性的檢測結(jié)果總是很低的原因。

fangke3546

剛開展飼用植酸酶活性的測定這個(gè)項(xiàng)目，檢測結(jié)果總是很低，相差很大，不知道是什么原因，方法如下：

飼用植酸酶活性的測定

一、適用范圍
  

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以分光光度法測定飼用植酸酶活性的方法。適用于作飼料添加劑用的植酸酶產(chǎn)品，也適用于添加有植酸酶的配合飼料、濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料。樣品最低檢出量為90U／kg。
二、方法原理
  

植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解低物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會生成黃色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]復(fù)合物，在波長415nm下進(jìn)行比色測定。
三、試劑和溶液

3.1
乙酸緩沖液(I)，c(CH3COONa·3H2O)為0.25mol／L：稱取34.02g三水乙酸鈉于1000 mL燒杯中，加入1000mL蒸餾水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至5.50±0.01。室溫下存放2個(gè)月有效。
3.2
乙酸緩沖液(Ⅱ)，c(CH3COONa·3H2O)為0．25mol／L：稱取34.02g三水乙酸鈉，0.5 g TritonX-100, 0.5g牛血清白蛋白于1000mL燒杯中，加入1000mL蒸餾水溶解，用冰乙酸調(diào)pH至5.50±0.01，室溫下存放2個(gè)月有效。
3.3
植酸鈉溶液，c(C6H6O24P6Na12)為7.5mmol／L：稱取0.6929g肌醇六磷酸鈉(C6H6O24P6Na12)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(3.1)溶解并定容至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配(實(shí)際反應(yīng)液中的最終濃度為5.0 mmol／L)。
3.4
硝酸溶液：1+2水溶液。
3.5
100g／L鉬酸銨溶液：稱取10g鉬酸銨[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL。容量瓶中，加入1．0mL氨水(25％)用水溶解定容至刻度。
3.6
2.35 g／L釩酸銨溶液：稱取0.235 g釩酸銨(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL硝酸溶液(3.4)，用水溶解定容至刻度。避光條件下保存一周有效。
3.7
顏色終止液：移取2份硝酸溶液(3.4)，1份鉬酸銨溶液(3.5)，1份釩酸銨溶液(3.6)混合后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。
3.8 磷酸二氫鉀(KH2PO4)：基準(zhǔn)物。
3.9
清洗試驗(yàn)用容器不要用含磷清洗劑。
四、儀器和設(shè)備
4.1
實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備.
4.2
恒溫水浴：(37±0.1)℃。
4.3
分光光度計(jì)：有10mm比色皿，可在415nm下測定吸光度。
4.4
磁力攪拌器。
4.5
渦流式混合器。
4.6
酸度計(jì)：精確至小數(shù)點(diǎn)后2位。
4.7
離心機(jī)：轉(zhuǎn)速為4000r／min以上。
4.8
秒表
五、試樣制備
   
取有代表性樣品，用四分法將試樣縮分至200g，植酸酶產(chǎn)品不需粉碎，配合飼料和添加劑預(yù)混合飼料需粉碎通過0.45mm標(biāo)準(zhǔn)篩，裝入密封容器，防止試樣成分變化。
六、測定步驟
6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
   
準(zhǔn)確稱取0．6804g在105℃烘至恒重的基準(zhǔn)磷酸二氫鉀(5．9)于100mL容量瓶中，用乙酸緩沖液(3．1)溶解，并定容至100mL濃度為50.0mmol／L。準(zhǔn)確移取磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（50mmol/L）0，1.0，2.0，3.0，4.0， 5.0ml于50ml容量瓶中，與試樣一起反應(yīng)測定，以無機(jī)磷濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，列出直線回歸方程(y＝ax+b)。
6.2 試樣溶液的制備
   
稱取0.5g—0.7g兩個(gè)試樣(表示酶活為6000U)精確至0.0001 g，同時(shí)稱取0.5g—0.7g參考樣(已知活性的植酸酶),分別置于100mL容量瓶中，加入約70mL乙酸緩沖液(3.2)，一個(gè)磁力棒，在磁力攪拌器上高速攪拌30min，用乙酸緩沖液(3.2)定容至刻度(減去磁力棒的體積)。搖勻，在離心機(jī)上以4000r／min離心10min。
分取1ml上清液,用乙酸緩沖液(3.2)定溶至100ml，搖勻,再吸取稀釋后的溶液10ml用乙酸緩沖液(3.1)定溶至100ml.使樣液濃度保持在0.08U／mL左右，待反應(yīng)。
6.3 反應(yīng)
   
取10mL試管按下面的反應(yīng)順序進(jìn)行操作，在反應(yīng)過程中，從加入底物(3.3)開始，向每支試管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對一致，37℃水解30min。反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見表2。
6.4
樣品測定



反應(yīng)后的試樣在室溫下靜置10min，如出現(xiàn)混濁需在離心機(jī)上以4000r／min離心10min，
上清液以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白調(diào)零，在分光光度計(jì)415 nm波長處測定樣品空白(A0)和樣品溶液(A)的吸光值，A-A0。為實(shí)測吸光值。用直線回歸方程計(jì)算植酸酶的活性。
   

表2

反應(yīng)順序	樣品、標(biāo)準(zhǔn)	樣品空白(標(biāo)準(zhǔn)空白)
1．加入待反應(yīng)液	2.0 mL	2 mL
2．37℃預(yù)熱5 min	√	－
3．依次加入底物(3.3)	4 mL	4 mL(第二步)
4．混合	√	√
5．37℃水解30min	√	－
6．依次加入終止液(3.7)	4 mL	4mL(第一步)
7．混合	√	√
總體積	10 mL	10 mL

七、結(jié)果計(jì)算

  

式中：
U——試樣中植酸酶的活性，U／g；
   
C——根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由直線回歸萬程計(jì)算出的酶活性，U；
   

F——試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù),50000；
   
M——試樣質(zhì)量，g；
   

30——反應(yīng)時(shí)間，min。
7.2
結(jié)果表示
   
兩個(gè)平行樣品的測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留整數(shù)。
7.3重復(fù)性
   
同一樣品兩個(gè)平行測定值的相對偏差，植酸酶產(chǎn)品不大于8％，添加植酸酶的各種飼料樣品不大于10％。

薛侃

你這個(gè)問題好像很難哦，可能就只有植酸酶生產(chǎn)廠家才測這個(gè)指標(biāo)。所以能跟你討論的人應(yīng)該很少。但我期待高手的出現(xiàn)！

zhengronghai

使用哪家的植酸酶啊？

fangke3546

倒是大廠家的
按理說不應(yīng)該這樣的，TritonX-100對檢測結(jié)果的影響到底有多大啊

tgz5637

哈哈，剛好我就是高手，很多賣酶的恐怕連酶檢測的基本概念都沒弄清。今天毛遂自薦、魯班面前耍大刀，關(guān)公面前弄弄斧。
1 牛血清白蛋白是穩(wěn)定劑，TritonX-100是表面活性劑，在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)里用得很多。兩個(gè)一塊用，無非是減少酶樣被浸提萃取及稀釋過程中酶的失活，減少酶在試管壁殘留，缺點(diǎn)是用量大后，產(chǎn)生的泡沫很多，不容易定容，可以稍微加幾滴無水酒精消泡，（乙醇在酶工業(yè)也用于提取，但濃度和時(shí)間有限制，濃度上限是20～30%（V/V)）,實(shí)際上，對于沒有加入飼料里的純酶檢測，如果馬上測定，不加影響不大，（但記住做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，也不能用乙酸緩沖液2，保證同樣條件才可以），如果用加了穩(wěn)定劑的緩沖液，比用不加的測定結(jié)果高一些。加入飼料的檢測，由于要萃取，故此要加，而且，穩(wěn)定劑的添加量要加大。
2  檢測偏低情況，多數(shù)是底物配制出問題，稱重很少出問題（除非你的儀器很久沒有校正了），必須先調(diào) pH，再來用緩沖液定容。（緩沖液在其緩沖范圍，如乙酸鹽的緩沖范圍是pH3.6～5.8，都有一定緩沖能力，調(diào)好pH再定容后的pH是不會改變的）。先定容后調(diào)pH,導(dǎo)致底物濃度不足，結(jié)果偏低。只用緩沖液溶解植酸鈉，不調(diào)pH,直接定容，測定結(jié)果也是偏低，因?yàn)閜H偏離5.5。
3
怎樣來理解酶活的定義呢？對采用分光光度法，采用的原理是對等比色，即同樣的確定條件下，
一個(gè)酶活單位分解植酸產(chǎn)生的產(chǎn)物的吸光度值等同于一微摩爾無機(jī)磷與顯色劑產(chǎn)生的吸光度值。在得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出測定吸光值對應(yīng)的無機(jī)磷的量，返推出酶活大小。要注意回歸方程的得到的代表無機(jī)磷量的單位是什么？你才能理解計(jì)算公式的含義。

另一種情況的可能性是你做標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算公式根本就不正確，導(dǎo)致計(jì)算公式錯(cuò)誤，結(jié)果偏低。
如果磷酸二氫鉀的濃度對OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度單位是微摩爾/mL, 回歸方程單位也換算成微摩爾/mL，計(jì)算公式=（回歸方程×稀釋倍）/(稱樣量×30)；如果是以磷酸二氫鉀的物質(zhì)的量對OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，物質(zhì)量單位是微摩爾，計(jì)算梯度時(shí)，要乘以0.2。計(jì)算公式=（回歸方程×稀釋倍）/(0.2×稱樣量×30)；

怎樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以找書自己看看。

4 例子：5000單位的植酸酶，稱樣0.8g,稀釋10000倍，OD=0.320, 回歸方程以磷酸二氫鉀的物質(zhì)的量對OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，為y=7.840x+0.002,代入第二公式計(jì)算，酶活=7.840×0.320×10000/(0.2×0.8×30)=5220u/g

5 其他可能出問題的地方，多數(shù)是些低級錯(cuò)誤！
       可能就是顯色劑配制沒配好，多數(shù)出在礬酸銨沒溶解好，量不夠，顯色偏低。如果偷懶，沒有每次重配顯色劑后，重測標(biāo)準(zhǔn)曲線，就套用原來的回歸公式，就犯錯(cuò)。或者查查硝酸液配對沒有。
      又或者植酸酶的萃取浸提時(shí)間不足，以上清液來測，酶活自然偏低。
      或者你的恒溫槽恒溫溫度有誤。或者分光光度計(jì)有問題。不是單色光，向濃度軸發(fā)生偏離。自然測定值低。
       不是自己測定回歸方程，而是使用別人提供的或在其他機(jī)器上測定的回歸方程，計(jì)算自然謬誤差之千里。

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-6-20 10:52 編輯 ]

fangke3546

不勝感激,請問我應(yīng)該怎么樣來檢驗(yàn)上述環(huán)節(jié)是否存在問題,怎樣解決這些問題呢
另外,我還想請問在計(jì)算的時(shí)候國家標(biāo)準(zhǔn)上提到"C——根據(jù)實(shí)際樣液的吸光值由直線回歸萬程計(jì)算出的酶活性，U",那C是怎么計(jì)算的啊?
我能貿(mào)然問一句,我能否電話與你聯(lián)系?

微塵

華南農(nóng)大近期有個(gè)有關(guān)酶制劑的檢測培訓(xùn)，是個(gè)不錯(cuò)的學(xué)習(xí)機(jī)會

fangke3546

什么時(shí)間,有具體信息嗎

fangke3546

tgz5637的分析非常透徹,我剛剛接觸植酸酶不久,不清楚各個(gè)因素的影響到底有多大,tgz5637能否更詳細(xì)的分析評估一下各個(gè)因素的影響.
我的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程的系數(shù)沒你的大,我的只有二點(diǎn)幾,不知到怎么回事,我懷疑標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作也存在一些問題.
我的郵箱是aipu_tchx@yahoo.com.cn,方便的話可否告知電話號碼.

fasetuan

確實(shí)是個(gè)很深奧的問題,沒有測過這個(gè)項(xiàng)目,學(xué)習(xí)中......